里氏木霉中糖苷酶的理性改造對于二糖合成-降解活性的影響.pdf

1、β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)是一種重要的工業(yè)應用酶。它同時具有寡糖水解和合成活性，既能水解寡糖生成相應的單糖，又能利用單糖合成寡糖。目前對于β-葡萄糖苷酶的研究方向主要集中在提高其水解活性上，而對其合成活性的研究相對較少。我們以里氏木霉胞內(nèi)的β-葡萄糖苷酶Cel1b蛋白作為研究對象，希望通過理性改造提高其二糖合成活性以獲得高效合成二糖的β-葡萄糖苷酶。我們首先通過同源模建模擬得到了Cel1b蛋白的三維結(jié)構，然后將Cel1

2、b蛋白和纖維二糖進行柔性對接，結(jié)果顯示纖維二糖的第二個葡萄糖殘基處于一個相對親水的環(huán)境(如N240)中，而其周圍仍存在部分疏水性氨基酸殘基如W173，I174，I177。我們據(jù)此提出了一個假說:β-葡萄糖苷酶的轉(zhuǎn)糖基活性與其二糖結(jié)合部位氨基酸的親疏水性有關，結(jié)合部位的疏水性的降低可能有助于提高其轉(zhuǎn)糖基活性。我們進一步通過點突變技術對Cel1b蛋白進行了定點突變，將其活性中心的疏水性氨基酸變?yōu)榱擞H水性的氨基酸，獲得了I177S、I177S

3、/I174S、I177S/I174S/W173H等三株活性中心親水性逐漸增強的蛋白;并在原始蛋白基礎上將親水性氨基酸突變?yōu)槭杷园被?，獲得了活性中心疏水性增強的蛋白N240I。
　　我們通過對上述理性改造獲得的四個突變體蛋白進行二糖合成與水解活性的鑒定，發(fā)現(xiàn)Cel1b蛋白及其突變體利用葡萄糖為底物可以合成昆布二糖、纖維二糖和槐糖三種二糖。當活性中心的親水性增加時，其二糖合成活性增加，水解活性降低;當結(jié)合位點的疏水性增加時，其二糖