2型糖尿病（消渴）從“脾”論治理論探討與實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、2型糖尿病(Type2 Diabetes mellitus，T2DM)是由多種病因引起的以慢性高血糖為特征的代謝紊亂性疾病，屬于中醫(yī)“消渴病”范疇?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為T2DM同時伴有因胰島素分泌或作用缺陷引起的糖、脂肪和蛋白質(zhì)異常代謝，胰島細(xì)胞功能缺陷和胰島素抵抗是T2DM的兩大病理生理基礎(chǔ)。
　　目的:
　　本研究提出從“脾”論治消渴(T2DM)的學(xué)術(shù)觀點(diǎn)，采用“運(yùn)脾津”治則指導(dǎo)下研制的藥物津力達(dá)顆粒作為藥物干預(yù)，通過建立T2D

2、M大鼠模型，觀察糖尿病胰島功能病變特征及津力達(dá)顆粒的干預(yù)作用及機(jī)制;高脂飲食誘導(dǎo)建立胰島素抵抗大鼠模型，觀察津力達(dá)顆粒對糖脂代謝及胰島素敏感性的干預(yù)作用及機(jī)制;建立軟脂酸誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞損傷模型，觀察津力達(dá)顆粒對INS-1細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制。通過上述整體動物和離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究，以期為消渴(T2DM)的治療提供有效方法與方藥，同時也為消渴病從“脾”論治提供實(shí)驗(yàn)支持。
　　方法:
　　本研究分為以下兩部分內(nèi)容:
　　理論研

3、究方法:本文系統(tǒng)梳理消渴病病名、病因、病機(jī)和治療的歷史源流，探析近代醫(yī)家張錫純提出的消渴“起于中焦而極于上下”理論及臨證應(yīng)用，從“脾”立論，提出“脾失健運(yùn)、水谷津液代謝異?！笔窍什≈饕C(jī)，“脾失健運(yùn)、痰瘀阻絡(luò)”是消渴病引發(fā)全身并發(fā)癥主要病機(jī)，確立“運(yùn)脾津”治則并綜合治脾諸法:益脾氣、養(yǎng)脾陰、燥脾濕、泄脾熱、溫脾陽、暢脾氣、通脾絡(luò)，形成津力達(dá)顆粒組方，分析津力達(dá)顆粒組方特點(diǎn)及其臨床及實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展，以期為消渴病治療提供有效治法與方藥。<

4、br>　　實(shí)驗(yàn)研究方法:
　　1.津力達(dá)顆粒對T2DM大鼠胰島功能干預(yù)作用研究
　　90只SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、吡格列酮組(4.5mg/kg體重)和津力達(dá)低、中、高劑量組（0.75、1.5、3.0g/kg體重），每組15只，除正常組外，其余各組予高脂飼料喂養(yǎng)。喂養(yǎng)6周后，腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)(30mg/kg)誘導(dǎo)T2DM模型，72h后血糖儀測定空腹血糖≥13.9mmol/L為模型成功，不符合標(biāo)準(zhǔn)者剔除。造模

5、成功后給藥6周，正常組和模型組給予等體積純水灌胃。造模后除正常組外，其余各組繼續(xù)予高脂飼料喂養(yǎng)。末次給藥后禁食12h，10％水合氯醛麻醉，腹主動脈取血分離血清，全自動生化儀檢測空腹血糖(FBG)、放射免疫法檢測空腹胰島素(FINS)以計算胰島β細(xì)胞功能指數(shù)(HOMA-β);透射電鏡觀察各組大鼠胰島β細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化;Westernblot方法檢測胰腺組織胱天蛋白酶3(Casepase3)、自噬相關(guān)蛋白(p62、Atg7、LC3Ⅰ、LC3

6、Ⅱ、Beclin-1)蛋白表達(dá);免疫組織化學(xué)方法觀察胰島細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白Beclin-1表達(dá)。
　　2.津力達(dá)顆粒對胰島素抵抗大鼠糖脂代謝及胰島素敏感性干預(yù)作用研究
　　動物分組同上，每組10只，除正常組外，其余各組予高脂飼料喂養(yǎng)6周，行口服糖耐量實(shí)驗(yàn)判斷動物是否造模成功，模型組空腹血糖＜13.9mmol/L、每個時間點(diǎn)血糖高于正常組且AUC面積與正常組有統(tǒng)計學(xué)差異，評價為模型成功。造模成功后給藥6周，正常組和模型組給予等體

7、積純水灌胃。造模后除正常組外，其余各組繼續(xù)予高脂飼料喂養(yǎng)。末次給藥后禁食12h，10％水合氯醛麻醉，腹主動脈取血分離血清，檢測FBG、FINS，計算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR);全自動生化儀檢測總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、游離脂肪酸(FFA);油紅O染色觀察各組大鼠肝臟細(xì)胞脂滴沉積情況;透射電鏡觀察各組大鼠肝臟細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化;ELISA法檢測血清大鼠血清抵

8、抗素(Resistin)、白介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子α（TNFα）水平;Western blot檢測肝臟細(xì)胞糖脂代謝相關(guān)通路(AMPK/ACC通路)中p-AMPK、AMPK、p-ACC、ACC蛋白表達(dá)、胰島素信號相關(guān)通路(PI3K/Akt通路)中p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、GLUT4蛋白表達(dá)。
　　3.津力達(dá)顆粒對軟脂酸(PA)誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞損傷的干預(yù)作用研究
　　體外培養(yǎng)INS-1細(xì)胞，以CC

9、K-8方法檢測不同濃度（100，200，300，400μg/mL）JLD對INS-1細(xì)胞生存活性的影響以判定津力達(dá)對細(xì)胞是否具有毒性;給予最適濃度JLD4h后，加入PA共同處理細(xì)胞24 h，CCK-8方法檢測細(xì)胞活性，RT-PCR方法檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白(BAX、Bcl-2)、Atg7、Beclin-1基因表達(dá);以CompoundC處理細(xì)胞，檢測其對PA損傷下INS-1細(xì)胞p62基因表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:
　　1.津力達(dá)顆

10、粒對2型糖尿病(T2DM)大鼠胰島功能干預(yù)作用研究結(jié)果:生化檢測結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組血糖升高、胰島素水平降低，胰島β細(xì)胞功能指數(shù)降低(P＜0.01）用藥組空腹血糖降低、空腹血清胰島素水平及血清胰島β細(xì)胞功能指數(shù)水平升高，其中津力達(dá)中、高劑量組與模型組比較具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01);電鏡結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠胰島β細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷，各用藥組大鼠胰島β細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷改善，胰島β細(xì)胞病變減輕;West

11、ernblot結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組凋亡相關(guān)蛋白Casepase3表達(dá)增加，自噬相關(guān)蛋白p62、LC3Ⅰ蛋白表達(dá)增加、Atg7、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)降低(P＜0.05，P＜0.01);與模型組比較，用藥組Casepase3表達(dá)降低，p62、LC3Ⅰ蛋白表達(dá)降低、Atg7、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)升高(P＜0.05);免疫組化結(jié)果均顯示，與正常組比較，模型組中胰島β細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白Beclin-1表達(dá)減少，與模型組相比，JLD組Beclin-

12、1表達(dá)增加，Westernblot結(jié)果顯示變化趨勢與免疫組化結(jié)果相同，且具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。
　　2.津力達(dá)顆粒對胰島素抵抗大鼠糖脂代謝及胰島素敏感性干預(yù)作用研究結(jié)果:
　　生化檢測結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠血清TC、TG、LDL-C、FFA水平顯著升高，HDL-C水平顯著下降(P＜0.01)。與模型組比較，津力達(dá)低劑量組對FFA的調(diào)整作用具有統(tǒng)計學(xué)意義，津力達(dá)中、高劑量組對TC、TG、FFA的調(diào)整作用具

13、有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。胰島素抵抗指數(shù)檢測顯示，實(shí)驗(yàn)?zāi)┠Ｐ徒M大鼠HOMA-IR升高(P＜0.01)，與模型組比較各用藥組HOMA-IR降低，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01);油紅O染色與電鏡結(jié)果顯示，模型組大鼠肝臟細(xì)胞中出現(xiàn)大量脂滴、肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷，各用藥組肝細(xì)胞內(nèi)月旨滴減少，大鼠肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷改善。ELISA結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠血清Resistin、IL6、TNFα水平升高（P＜0.0

14、1），與模型組比較，津力達(dá)中高劑量組Resistin、TNFα水平降低，津力達(dá)高劑量組IL6水平降低，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05,P＜0.01)。Western blot結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠肝臟p-ACC、p-AMPK蛋白表達(dá)降低(P＜0.01）;與模型組比較，用藥組肝臟p-ACC、p-AMPK表達(dá)增加(P＜0.01);與正常組比較，模型組大鼠肝臟p-PI3K、p-Akt、GLUT4表達(dá)降低，用藥組大鼠肝臟p-PI3K、

15、p-Akt、GLUT4表達(dá)增加，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01）。
　　3.津力達(dá)顆粒對軟脂酸(PA)誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞損傷的干預(yù)作用研究結(jié)果:
　　CCK-8結(jié)果顯示，津力達(dá)各用藥劑量組細(xì)胞較正常組細(xì)胞生存活性無統(tǒng)計學(xué)差異;PA損傷后INS-1細(xì)胞生存活性降低，BAX、Atg7、Beclin-1基因表達(dá)增加，Bcl-2基因表達(dá)降低(P＜0.01），用藥后，細(xì)胞生存活性增加(P＜0.01)，細(xì)胞BAX基因表達(dá)減少，Bcl-2

16、、Atg7、Beclin-1基因表達(dá)增加;CompoundC能阻斷PA環(huán)境下津力達(dá)對p62基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用(P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　1.理論研究:本研究基于近代名醫(yī)張錫純《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》提出的“消渴一證，古有上中下之分，謂其證皆起于中焦而極于上下”學(xué)術(shù)思想，在系統(tǒng)整理研究歷代醫(yī)家關(guān)于消渴病病名、病因、病機(jī)及治療研究基礎(chǔ)上，提出從“脾”論治消渴學(xué)術(shù)觀點(diǎn)，指出機(jī)體水液代謝與輸布、飲食精微轉(zhuǎn)輸與利用的紊亂及不平衡狀態(tài)

17、為其發(fā)病之關(guān)鍵，提出“脾失健運(yùn)、水谷津液代謝異?！笔窍什≈饕C(jī)，“脾失健運(yùn)、痰瘀阻絡(luò)”是消渴病引發(fā)全身并發(fā)癥主要病機(jī)，確立“運(yùn)脾津”治則并綜合治脾諸法:益脾氣、養(yǎng)脾陰、燥脾濕、泄脾熱、溫脾陽、暢脾氣、通脾絡(luò)，并據(jù)此形成滓力達(dá)顆粒組方，為消渴病(T2DM)臨床防治研究開辟了有效途徑和藥物。
　　2.實(shí)驗(yàn)研究:體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，津力達(dá)顆粒有效調(diào)節(jié)T2DM大鼠血糖及胰島素分泌，保護(hù)β細(xì)胞結(jié)構(gòu)，維持胰島功能，減少胰島細(xì)胞凋亡，保護(hù)胰島細(xì)胞

18、數(shù)量。同時調(diào)整胰島素抵抗大鼠糖脂代謝，調(diào)節(jié)血清脂肪因子及炎癥因子，減輕肝臟脂質(zhì)沉積，改善胰島素敏感性，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)AMPK/ACC及PI3K/Akt信號通路有關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，津力達(dá)顆粒改善軟脂酸誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞損傷，增加其生存活性，激活其自噬，機(jī)制可能與激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)相關(guān)通路有關(guān)。
　　通過以上實(shí)驗(yàn)研究佐證了消渴從“脾”論治的科學(xué)價值，驗(yàn)證了津力達(dá)在改善胰島素抵抗、治療T2DM方面的確切作用，為臨床治