從絡(luò)病學(xué)說論治糖尿病腎病的理論探討和實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：應(yīng)用絡(luò)病學(xué)說探討糖尿病腎病的中醫(yī)病機(jī)，研制出中藥通腎絡(luò)膠囊，觀察其對(duì)DN大鼠的腎臟保護(hù)作用及對(duì)體外培養(yǎng)正常及高糖狀態(tài)下大鼠腎小球系膜細(xì)胞的增生、細(xì)胞周期、細(xì)胞因子、分泌產(chǎn)物及凋亡的影響，探討其對(duì)DN的腎臟保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制，為絡(luò)病學(xué)說診治DN提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，反證通腎絡(luò)膠囊組方的科學(xué)性，進(jìn)一步佐證絡(luò)病學(xué)說的科學(xué)價(jià)值。 方法：理論探討：在搜集整理歷代醫(yī)家有關(guān)論述及當(dāng)代關(guān)于糖尿病腎病文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，依據(jù)絡(luò)病學(xué)說探討DN中醫(yī)病機(jī)，指出

2、氣陰兩虛是DN的發(fā)病基礎(chǔ)，絡(luò)脈瘀阻、津凝痰聚是DN的主要病理環(huán)節(jié)，絡(luò)息成積是DN主要病理改變。確立”益氣養(yǎng)陰，祛瘀化痰、通絡(luò)消積”的治法，并據(jù)此制定通腎絡(luò)膠囊組方。 結(jié)果：1通腎絡(luò)膠囊對(duì)DN大鼠腎臟保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究：給藥八周后，與模型組比較，通腎絡(luò)高劑量組體重顯著增加(p＜0.01)；纈沙坦組、通腎絡(luò)低、中、高劑組飲食量、飲水量顯著降低(p＜0.05，或p＜0.01)。與模型組比較，各治療組24h尿量均有顯著降低(p＜

3、0.05，或p＜0.01)。 注射STZ72h后，與假手術(shù)組比較，造模組血糖顯著增高(p＜0.01)；組間無差異。給藥四周后，與模型組比較，纈沙坦組、通腎絡(luò)高劑組空腹血糖水平顯著降低(p＜0.01)。給藥八周后，糖適平組、通腎絡(luò)中、高劑組空腹血糖水平顯著降低，(p＜0.05，或p＜0.01)。 與模型組比較，通腎絡(luò)高劑組肌酐清除率顯著增高(p＜0.01)。 給藥四周后和給藥八周后，與模型組比較，纈沙坦組、通腎絡(luò)中

4、、高劑組尿微量白蛋白顯著降低(p＜0.05)。 與模型組比較，通腎絡(luò)中、高劑組腎臟系數(shù)顯著降低，分別(p＜0.05，或p＜0.01)。 HE染色結(jié)果顯示：模型組：腎小球體積增大，系膜細(xì)胞增多，少數(shù)腎小球呈分葉狀，腎小球毛細(xì)血管擴(kuò)張。小管上皮細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)空泡變性，腎間質(zhì)可見局灶性炎性細(xì)胞浸潤。 通腎絡(luò)低劑量組：纈沙坦組、糖適平組、通腎絡(luò)中、高劑組：腎小球內(nèi)毛細(xì)血管擴(kuò)張減輕，與模型組相比，腎小管病變輕微，未見炎癥性損傷

5、。 Masson染色結(jié)果：模型組：腎小球系膜基質(zhì)明顯增多，腎小球基底膜增厚，部分腎小管上皮空泡及顆粒變性。 各治療組：系膜基質(zhì)較模型組明顯減少，腎小管空泡及顆粒變性較模型組減輕。各治療組之間無明顯差異。 電鏡：模型組：基底膜增厚明顯，厚薄不均，足突、次級(jí)突起融合明顯，血管內(nèi)皮細(xì)胞增生、裂孔減少明顯。 各治療組：部分基底膜中等增厚，部分增厚不明顯，足突融合較明顯，血管內(nèi)皮細(xì)胞增生較模型組減輕。 2通

6、腎絡(luò)膠囊對(duì)DN大鼠TGFβ1、MMP-2、TIMP-2的影響：與模型組比較，通腎絡(luò)組TGF-β1顯著降低(p＜0.01)，其它各組無差異(p＞0.05)。與模型組比較，各治療組MMP-2均顯著增加(p＜0.01)，TIMP-2顯著降低(p＜0.01)，各治療組間無差異(p＞0.05)。 3通腎絡(luò)含藥血清對(duì)大鼠腎系膜細(xì)胞增生抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果：與正常大鼠同濃度血清組及其它濃度通腎絡(luò)含藥血清組相比，10％通腎絡(luò)含藥血清組作用72h時(shí)細(xì)胞增

7、生抑制明顯(P＜0.05)。 4通腎絡(luò)含藥血清體外培養(yǎng)大鼠腎系膜細(xì)胞的周期分析結(jié)果：與對(duì)照組相比，10％含藥血清組在48hG0/G1期細(xì)胞數(shù)增多，S期細(xì)胞減少，PI有下降趨勢(shì)，72h時(shí)明顯下降(p＜0.01)；5％含藥血清組與對(duì)照組相比在72h時(shí)PI增加明顯，48h時(shí)則無明顯差異；2.5％含藥血清組72h時(shí)PI增加，在72h下降(p＜0.01)。 5通腎絡(luò)含藥血清對(duì)體外培養(yǎng)高糖狀態(tài)下系膜細(xì)胞凋亡的結(jié)果：流式細(xì)胞術(shù)和TUN

8、EL檢測結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，10％通腎絡(luò)含藥血清，能促進(jìn)高糖狀況下系膜細(xì)胞的凋亡(p＜0.05或p＜0.01)。 6通腎絡(luò)對(duì)高糖狀態(tài)下大鼠腎系膜細(xì)胞TGF-β1mRNA及細(xì)胞上清TGF-β1含量的影響： 與正常對(duì)照組相比，在高糖、高糖+ET-1、高糖+ANGⅡ不同條件下，系膜細(xì)胞TGF-β1mRNA轉(zhuǎn)錄水平增高(p＜0.01)，T/G比值均增高(p＜0.01)；與高糖組相比，高糖+ANGⅡ組T/G比值增高(p＜0.0

9、5)，而高糖+ET-1組T/G比值降低(p＜0.05)。 與模型組相比，通腎絡(luò)含藥血清組系膜細(xì)胞TGF-β1mRNA轉(zhuǎn)錄下降(p＜0.05)，T/G比值降低(p＜0.05)。 通腎絡(luò)DMSO溶液對(duì)高糖、高糖+ET-1、高糖+ANGⅡ狀態(tài)下系膜細(xì)胞TGF-β1mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響：通腎絡(luò)DMSO組與模型組相比，T/G比值均降低(p＜0.05)，通腎絡(luò)DMSO組與纈沙坦相比，在高糖條件下，T/G比值無差異，在高糖+ET-1

10、條件下，T/G降低(P＜0.05)；在高糖+ANGⅡ條件下，T/G增高(P＜0.05)。 通腎絡(luò)含藥血清與通腎絡(luò)DMSO組相比較：通腎絡(luò)含藥血清與通腎絡(luò)DMSO組之間T/G無差異。 在高糖、高糖+ET-1、高糖+ANGⅡ不同狀態(tài)下細(xì)胞上清TGF-β1含量測定：與正常組相比高糖、高糖+ET-1、高糖+ANGⅡ條件下細(xì)胞上清TGF-β1含量明顯升高，有非常顯著差異(p＜0.01)，與高糖組相比，高糖+ET-1組細(xì)胞上清TGF

11、-β1含量明顯下降(p＜0.01)。 通腎絡(luò)含藥血清刺激后細(xì)胞上清TGF-β1含量測定：與模型組相比，通腎絡(luò)含藥血清細(xì)胞上清TGF-β1含量顯著下降(p＜0.01)。 通腎絡(luò)DMSO對(duì)細(xì)胞上清TGF-β1的影響：與模型組相比，通腎絡(luò)DMSO溶液刺激下細(xì)胞上清TGF-β1含量顯著下降(p＜0.01)。與纈沙坦組相比，高糖+ANGⅡ+通腎絡(luò)DMSO組細(xì)胞上清TGF1β1含量水平升高(p＜0.05)。 與通腎絡(luò)DMSO

12、組相比高糖+ET-1+通腎絡(luò)血清、高糖+ANGⅡ+通腎絡(luò)血清細(xì)胞上清TGF1β1含量水平升高(p＜0.01)。 7通腎絡(luò)對(duì)高糖狀態(tài)下大鼠腎系膜細(xì)胞金屬蛋白酶及抑制物的影響：與正常對(duì)照組相比，在高糖組、高糖+ET-1組、高糖+ANGⅡ狀態(tài)下，MMP2/GAPDH均降低(p＜0.01)，MMP2/TIMP2比值降低(P＜0.01)，高糖+ANGⅡ組TIMP2/GAPDH值升高(P＜0.05)。 與模型組相比，通腎絡(luò)含藥血清組

13、MMP2/GAPDH均升高(p＜0.05或0.01)，MMP2/TIMP2比值升高(P＜0.01)；在高糖及高糖+ET-1狀態(tài)下，通腎絡(luò)含藥血清TIMP2/GAPDH比值降低得更為顯著(P＜0.01)。 與模型組相比，通腎絡(luò)DMSO組MMP-2mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯升高(p＜0.05)，TIMP-2mRNA水平降低(p＜0.05)，MMP2/TIMP2比值升高(p＜0.05)。 與纈沙坦組相比，通腎絡(luò)DMSO組在高糖、高糖

14、ET-1條件下，MMP-2mRNA、TIMP-2mRNA、MMP2/TIMP2無差異(p＞0.05)，在高糖+ANGⅡ條件下纈沙坦TIMP2/GAPDH降低(p＜0.05)，而通腎絡(luò)DMSO組MMP-2/GAPDH升高更為明顯(p＜0.05)，兩者M(jìn)MP2/TIMP2比值之間無差異。 通腎絡(luò)DMSO組與通腎絡(luò)含藥血清組各組間MMP2/GAPDH、TIMP2/GAPDH、MMP2/TIMP2比值無差異(p＞0.05)。 8

15、通腎絡(luò)對(duì)細(xì)胞上清產(chǎn)物FN、ColⅣ影響的檢測結(jié)果：與正常組相比，在高糖、高糖+ET-1、高糖+ANGⅡ狀態(tài)下，細(xì)胞上清FN、COLⅣ含量均顯著增高(p＜0.01)；高糖+ANGⅡ組細(xì)胞上清FN、COLⅣ含量高于高糖組(P＜0.05)；與高糖+ET-1組相比較，高糖+ANGⅡ組細(xì)胞上清COLⅣ含量增高(P＜0.05)。 與模型組相比，通腎絡(luò)含藥血清細(xì)胞上清FN明顯下降(p＜0.01)，ColⅣ在高糖、高糖+ANGⅡ條件下下降(p＜

16、0.05)。 與模型組相比，通腎絡(luò)DMSO組能顯著降低高糖培養(yǎng)下的細(xì)胞上清中的FN及ColⅣ含量(p＜0.05)。與纈沙坦相比，兩者無差異。 通腎絡(luò)DMSO溶液與通腎絡(luò)含藥血清相比較，細(xì)胞上清FN、COLⅣ含量無差異(p＞0.05)。 結(jié)論：1首先運(yùn)用絡(luò)病學(xué)說探討糖尿病腎病的中醫(yī)病機(jī)，指出糖尿病腎病是在糖尿病氣陰兩虛日久基礎(chǔ)上，由于絡(luò)脈瘀阻、津凝痰聚，終至絡(luò)息成積的結(jié)果，其絡(luò)息成積的病理基礎(chǔ)與DN腎臟ECM成分及

17、其調(diào)控機(jī)制具有內(nèi)在相關(guān)性。 2采用單側(cè)腎臟切除并腹腔注射STZ的方法建立DN大鼠模型，觀察通腎絡(luò)膠囊對(duì)模型大鼠腎功能、糖代謝及細(xì)胞外基質(zhì)的影響，結(jié)果表明通腎絡(luò)膠囊可以降低模型大鼠空腹血糖、尿微量白蛋白、腎臟系數(shù)，減慢肌酐清除率的下降，發(fā)揮保護(hù)腎臟的作用。 3通腎絡(luò)既可以影響使正常大鼠系膜細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞數(shù)增多，S期細(xì)胞減少，PI下降，從而抑制其增殖，又能促進(jìn)高糖狀態(tài)下系膜細(xì)胞凋亡；還可以降低DN大鼠腎組織和高糖狀態(tài)下