中草藥DNA整合鑒定系統(tǒng)研究——以含馬兜鈴酸類藥材和穿龍薯蕷為例.pdf

1、中草藥的真?zhèn)舞b定是保證其療效和安全性的基礎(chǔ)。隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，傳統(tǒng)的中藥鑒定方法不斷吸收新技術(shù)和新方法，推動(dòng)中藥鑒定由傳統(tǒng)鑒定向現(xiàn)代鑒定發(fā)展，為了滿足種類繁多的中草藥的鑒別需求，結(jié)合傳統(tǒng)鑒定技術(shù)來建立綜合的中草藥 DNA鑒定系統(tǒng)是非常有必要的。本文以含馬兜鈴酸類藥材和薯蕷屬近緣物種為研究對(duì)象，分別采用TaqMan探針、LAMP技術(shù)和DNA條形碼技術(shù)對(duì)馬兜鈴科植物及其混用品進(jìn)行快速檢測(cè)和物種鑒定，超級(jí)條形碼葉綠體基因組對(duì)穿龍薯蕷

2、及同屬近緣物種進(jìn)行鑒定，超高效液相-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（UHPLC-HR-MS）對(duì)馬兜鈴科植物和其易混淆物種進(jìn)行化學(xué)成分檢測(cè)，并在此基礎(chǔ)上提出了中草藥DNA整合鑒定系統(tǒng)的設(shè)想和構(gòu)成，為綜合鑒定種類繁多的中草藥以及解決一些鑒定難題奠定了基礎(chǔ)。
　　本文采用TaqMan探針來快速、準(zhǔn)確的鑒定馬兜鈴科植物。馬兜鈴酸（AAs）是一類存在于馬兜鈴科植物中的有機(jī)化合物，該科多種植物作為中藥材在廣泛使用。然而，由于相近的中文名稱、相似的用藥習(xí)慣

3、以及植物形態(tài)，馬兜鈴科植物容易和其它藥材混淆和混用，由此導(dǎo)致的馬兜鈴酸腎病事件曾引起極大關(guān)注。然而，主要依賴于性狀特征和顯微特征的傳統(tǒng)鑒定方法，很難準(zhǔn)確鑒定喪失了一些性狀信息的干燥植物材料或者某個(gè)藥材部位。為了保護(hù)消費(fèi)者的權(quán)益，迫切需要建立一套鑒別含馬兜鈴酸植物的有效方法。本研究全面系統(tǒng)的收集了馬兜鈴科植物及被其混用的物種289份，隸屬于13科24屬79個(gè)物種，其中馬兜鈴科的四個(gè)屬（馬兜鈴屬、細(xì)辛屬、馬蹄香屬、線果兜鈴屬）46個(gè)物種共有

4、158份樣品，其易混淆物種隸屬于12科20屬33個(gè)物種共131份樣品。從收集的289份樣品中得到了282條 ITS2序列。在此基礎(chǔ)上，根據(jù)馬兜鈴科植物的 ITS2序列信息，我們?cè)O(shè)計(jì)了11對(duì)引物和探針組合，能夠靈敏準(zhǔn)確的檢測(cè)到馬兜鈴科植物的正常熒光信號(hào)，因此，基于Real-Time PCR的TaqMan探針技術(shù)可快速準(zhǔn)確的檢測(cè)出馬兜鈴科植物。
　　采用LAMP方法對(duì)木通和關(guān)木通進(jìn)行快速可視化鑒別。2015版《中國(guó)藥典》規(guī)定木通來源于

5、木通Akebia quinata(Houtt.) Decne.、三葉木通Ak. trifoliata(Thunb.) Koidz.和白木通Ak. trifoliata(Thunb.) Koidz. var. australis(Diels) T. Shimizu的干燥藤莖。關(guān)木通藥材則為木通馬兜鈴Aristolochia manshuriensisKomarov的干燥藤莖。本文基于木通馬兜鈴Ar. manshuriensis的ITS2序

6、列設(shè)計(jì)并經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選得到了一組LAMP引物，包括四條普通引物(G-F3, G-B3, G-FIP, G-BIP)和一條環(huán)引物(G-LB)。在65℃下進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增，60 min內(nèi)成功完成LAMP擴(kuò)增反應(yīng)，并且同時(shí)可進(jìn)行可視化檢測(cè)。關(guān)木通的三份樣品 LAMP反應(yīng)呈陽性，LAMP反應(yīng)開始于25-30 min并且在45-60 min接近飽和。相對(duì)的，木通的三個(gè)基原物種共9份樣品在60 min的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)都呈現(xiàn)陰性。當(dāng)LAMP反應(yīng)結(jié)束時(shí)，關(guān)木通

7、的樣品即陽性樣品的產(chǎn)物顏色從開始的橙色變成綠色，但是陰性樣品即木通的顏色一致保持橙色沒變。通過與傳統(tǒng)PCR比較，我們發(fā)現(xiàn)LAMP反應(yīng)的靈敏度比傳統(tǒng)PCR高10倍，這證明了對(duì)于檢測(cè)關(guān)木通，LAMP技術(shù)是可行的并且是有優(yōu)勢(shì)的。LAMP技術(shù)是一個(gè)潛在的、有價(jià)值的、簡(jiǎn)單有效的快速鑒別木通和混偽品關(guān)木通的方法。
　　采用DNA條形碼技術(shù)對(duì)馬兜鈴科植物及其混用品進(jìn)行物種鑒別。本研究全面系統(tǒng)的收集了馬兜鈴科植物及被其混用的物種289份，隸屬于1

8、3科24屬79個(gè)物種，其中馬兜鈴科的四個(gè)屬（馬兜鈴屬、細(xì)辛屬、馬蹄香屬、線果兜鈴屬）46個(gè)物種共有158份樣品，其易混淆物種隸屬于12科20屬33個(gè)物種共131份樣品，此外，還從GenBank中下載了細(xì)辛屬13個(gè)物種的15條ITS2序列和非馬兜鈴科混用物種的6條ITS2序列和4條psbA-trnH序列。從收集的289份樣品中得到了282條ITS2序列和185條psbA-trnH序列，所得序列已經(jīng)提交至GenBank數(shù)據(jù)庫。DNA條形碼技

9、術(shù)研究結(jié)果表明，使用BLAST1、最近距離法在屬級(jí)水平鑒定馬兜鈴科和非馬兜鈴科混用物種的鑒定效率為100％。在NJ（neighbor-joining）樹中，馬兜鈴科植物聚為一支，非馬兜鈴科混用物種聚為另一支。因此，以ITS2為主，psbA-trnH為輔的DNA條形碼技術(shù)能快速準(zhǔn)確的鑒別馬兜鈴科及其非馬兜鈴科混用物種。
　　本文采用超級(jí)條形碼葉綠體基因組來解決DNA條形碼無法鑒別的部分近緣物種，以薯蕷屬植物穿龍薯蕷和其同屬近緣植物的

10、鑒別為實(shí)例。穿龍薯蕷Dioscorea nipponicaMakino是薯蕷科薯蕷屬一個(gè)重要的藥用植物，薯蕷科植物對(duì)于單子葉植物的進(jìn)化非常重要。在前期的研究中發(fā)現(xiàn)對(duì)于薯蕷屬植物的鑒定，并沒有篩選到合適的條形碼。在本文中，我們測(cè)定了穿龍薯蕷D. nipponica的葉綠體基因組。采用Illumina Miseq300基因組分析儀測(cè)序，Soapdenovo suite進(jìn)行拼接，同屬物種龜甲龍D. elephantipes(NC_009601

11、.1)的葉綠體基因組作為參考基因組。拼接好的序列已經(jīng)提交到GenBank上，登錄號(hào)為KP404629。穿龍薯蕷的葉綠體基因組總長(zhǎng)度為152,946 bp，富含AT堿基(含量為63.3%)，包含一對(duì)23,113 bp反向重復(fù)區(qū)、大單拷貝區(qū)(LSC)長(zhǎng)度為83,557 bp和小單拷貝區(qū)(SSC)長(zhǎng)度為23,064 bp。共編碼120個(gè)基因，包含89個(gè)蛋白編碼基因、27個(gè)tRNA基因和4個(gè) rRNA基因。預(yù)測(cè)的基因編碼區(qū)覆蓋了基因組序列的58

12、.7%，其中12個(gè)基因包含有內(nèi)含子。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示葉綠體基因組可以作為鑒定穿龍薯蕷和其同屬近緣物種的一個(gè)超級(jí)條形碼，而且，此葉綠體基因組將為繼續(xù)研究穿龍薯蕷提供分子基礎(chǔ)。
　　本文采用 UHPLC-HR-MS技術(shù)定性檢測(cè)馬兜鈴科植物及其混用品當(dāng)中的AAⅠ和AAⅡ。本研究廣泛系統(tǒng)的收集了馬兜鈴科和非馬兜鈴科的易混淆物種，以AAⅠ和AAⅡ?yàn)閷?duì)照品，通過UHPLC-HR-MS檢測(cè)馬兜鈴科45個(gè)物種和非馬兜鈴科30個(gè)物種，AAⅠ和AA

13、Ⅱ分別在m/z340.0469和310.0366被檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示馬兜鈴科39個(gè)物種含有AAⅠ，這其中有14個(gè)物種同時(shí)也含有AAⅡ，非馬兜鈴科的植物不含有AAⅠ和Ⅱ，檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)大部分馬兜鈴科植物含有馬兜鈴酸，為鑒別含馬兜鈴酸植物提供了一個(gè)有效的驗(yàn)證方法。
　　現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)已經(jīng)在藥用植物鑒定方面顯示了很大的優(yōu)勢(shì)，那么面對(duì)繁多的新方法、新技術(shù)，如何根據(jù)不同的鑒別需求來選擇合適的鑒定方法是大家都關(guān)注的重點(diǎn)，本文通過分析具體案例

14、并結(jié)合傳統(tǒng)鑒定技術(shù)，建立了中草藥DNA整合鑒定系統(tǒng)，提出了DNA整合鑒定系統(tǒng)的構(gòu)成和方法流程，為選擇合適的鑒定方法提供了依據(jù)，為控制中藥材的來源和質(zhì)量奠定了基礎(chǔ)，為保護(hù)消費(fèi)者的權(quán)益提供了保證。
　　中草藥DNA整合鑒定系統(tǒng)的構(gòu)成為：以TaqMan探針和LAMP方法為主體的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)體系、DNA條形碼鑒別體系、超級(jí)條形碼葉綠體基因組鑒別近緣物種體系。從應(yīng)用性角度將中草藥DNA整合鑒定系統(tǒng)的鑒定流程分為以下四個(gè)部分：第一，為了滿足快

15、速、靈敏和簡(jiǎn)便的鑒別目的，可采用快速檢測(cè)體系對(duì)中藥材進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)快速鑒定。第二，為了構(gòu)建DNA條形碼數(shù)據(jù)庫或者進(jìn)行物種鑒定和溯源，可采用DNA條形碼技術(shù)得到物種的條形碼序列并進(jìn)行物種鑒定及溯源。第三，對(duì)于DNA條形碼鑒別無法解決的近緣物種，可采用超級(jí)條形碼葉綠體基因組鑒別。第四，對(duì)于可正常獲取DNA的常規(guī)樣品，LC或LC-MS檢測(cè)方法可用來驗(yàn)證DNA鑒別方法；而對(duì)于 DNA降解嚴(yán)重和獲取 DNA困難的鑒別對(duì)象，LC或LC-MS檢測(cè)方法可用作