中成藥原料藥材DNA條形碼分子鑒定——以崗梅、九里香及血藤類(lèi)藥材為例.pdf

1、中藥材DNA條形碼分子鑒定技術(shù)可快速準(zhǔn)確鑒定物種，突破了傳統(tǒng)鑒定方法主要依賴經(jīng)驗(yàn)、受形態(tài)和化學(xué)特征影響的限制，實(shí)現(xiàn)了中藥材從主觀性狀鑒定到客觀基因判定的技術(shù)革命。目前，中藥材DNA條形碼分子鑒定法指導(dǎo)原則已納入《中華人民共和國(guó)藥典》，為中草藥產(chǎn)品原料的安全、準(zhǔn)確提供了保障。本研究基于DNA條形碼技術(shù)對(duì)華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司的崗梅、九里香及血藤類(lèi)等中成藥原料藥材進(jìn)行了鑒定研究，探討了中藥材DNA條形碼分子鑒定技術(shù)體系在中成藥原料藥材實(shí)際

2、鑒定工作中的操作流程及應(yīng)用價(jià)值。并基于這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)構(gòu)建了華潤(rùn)三九中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)。得到以下主要結(jié)論:
　　(1)應(yīng)用ITS2序列對(duì)93份崗梅藥材及其近緣物種進(jìn)行鑒定研究。采用相似性搜索法、最近距離法、構(gòu)建NJ樹(shù)對(duì)序列鑒定能力進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果顯示不同來(lái)源的崗梅樣品均可獲得ITS2序列，種內(nèi)K2P遺傳距離為0-0.030，崗梅藥材及其近緣物種的種間最小K2P距離為0.043。崗梅藥材和基原物種樣品在NJ樹(shù)中聚為一支，能有效地與

3、其他物種分開(kāi)，相似性搜索法結(jié)果表明ITS2序列能夠準(zhǔn)確鑒定崗梅藥材及其近緣種。因此ITS2序列能夠準(zhǔn)確鑒定崗梅藥材及其近緣物種，該技術(shù)可用于確保崗梅藥材原料的準(zhǔn)確投料。
　　(2)基于ITS2序列對(duì)蕓香科九里香屬的8個(gè)物種共98份樣本進(jìn)行鑒定分析。采用最近距離法、建樹(shù)法、BLAST鑒定法以及SNPs位點(diǎn)分析，綜合評(píng)估該序列的鑒定能力。結(jié)果顯示，基于K2P遺傳距離分析的方法不能有效區(qū)分九里香、千里香和翼葉九里香。在UPGMA樹(shù)中，不

4、同物種顯示出單系性。BLAST鑒定結(jié)果亦表明ITS2序列能夠準(zhǔn)確鑒定中藥九里香。SNP位點(diǎn)查找發(fā)現(xiàn)，有3個(gè)穩(wěn)定且明顯的SNP標(biāo)記可用于區(qū)分九里香Murraya exotica與其他物種。綜上所述，ITS2序列可用于中藥九里香及其同屬近緣物種的鑒定。
　　(3)2015版藥典收載的雞血藤、大血藤、滇雞血藤均有“血藤”之稱(chēng)，分別基于ITS2和psbA-trnH序列對(duì)來(lái)自3個(gè)科8個(gè)種的110份血藤類(lèi)藥材樣本進(jìn)行鑒定研究。利用DNAMAN

5、進(jìn)行序列相似性分析，BLAST鑒定，構(gòu)建NJ樹(shù)用以評(píng)估它們對(duì)血藤類(lèi)藥材的鑒定能力。結(jié)果表明，雞血藤、大血藤、滇雞血藤的ITS2種內(nèi)序列相似度分別為98.1-100.0％，96.6-100.0％和99.6-100.0％，均高于其種間序列相似性，psbA-trnH序列的種內(nèi)序列相似度也高于其種間序列相似性。兩種序列的BLAST鑒定效率均為100％。在NJ樹(shù)中，雞血藤、大血藤、滇雞血藤均能各自單獨(dú)聚為一支，能明顯的與其他非藥典物種區(qū)分開(kāi)。因此

6、，DNA條形碼技術(shù)能準(zhǔn)確鑒定血藤類(lèi)藥材及其混偽品，可作為傳統(tǒng)鑒定方法的有效補(bǔ)充。由ITS2序列轉(zhuǎn)換成的二維DNA條形碼將為血藤類(lèi)藥材的流通管理提供便利。
　　(4)基于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)構(gòu)建了華潤(rùn)三九中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)，針對(duì)華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司的藥材特點(diǎn)進(jìn)行專(zhuān)門(mén)設(shè)計(jì)和構(gòu)建，并設(shè)計(jì)了個(gè)性化的專(zhuān)業(yè)鑒定軟件，以光盤(pán)的形式展示。該鑒定系統(tǒng)能夠針對(duì)公司所用中藥材進(jìn)行高效、快捷、準(zhǔn)確的鑒定，大大加快了原料藥的采購(gòu)進(jìn)度，推進(jìn)了公司中藥鑒定的標(biāo)