基于小鼠外感寒濕模型探討外感寒濕傷脾機制的理論及實驗研究.pdf

1、目的：
　　寒邪和濕邪共同致病,即為寒濕之邪。寒、濕之邪為陰邪,最易損傷陽氣。從中醫(yī)傳統(tǒng)理論角度探討外感寒濕致病的病因病機和治療法則對外感寒濕致病的研究有著重要意義。本研究擬通過建立外感寒濕模型，探討外感寒濕傷脾的致病機理和散寒祛濕法對外感寒濕的治療作用。
　　方法：
　　1.理論研究：
　　查閱相關文獻，歸納總結(jié)寒邪、濕邪的致病特點，探討外感寒濕致病傷脾的致病途徑、病機和治法。
　　2.實驗研究：

2、　　45只SPF級昆明小鼠適應性飼養(yǎng)1周后按體重隨機分為3組：
　　①正常對照組（下稱正常組）：昆明小鼠15只，常規(guī)室溫（15-20℃）喂養(yǎng)。
　　②外感寒濕組（下稱模型組）：昆明小鼠15只，連續(xù)7天每天中午12：00-16：00將小鼠臵于溫度為（4±0.5）℃、濕度為90％±2的人工氣候箱中飼養(yǎng)4h，其余時間按常規(guī)室溫飼養(yǎng)。按0.13ml/10g標準每天給予生理鹽水灌胃。
　　③藥物組（下稱治療組）：昆明小鼠15只，

3、連續(xù)7天每天中午12：00-16：00將小鼠臵于溫度為（4±0.5）℃、濕度為90%±2的人工氣候箱中飼養(yǎng)4h，其余時間按常規(guī)室溫飼養(yǎng)，根據(jù)人與小鼠體表面積換算，按0.13ml/10g體重標準每天給予加減腎著湯灌胃。取血后頸椎脫臼處死存活動物。無菌條件下收集小鼠結(jié)腸糞便，留取小鼠小腸組織。觀察小鼠生存狀態(tài)、分析小鼠體重變化、平板計數(shù)腸道細菌，采用病理組織學觀察小腸病理結(jié)構(gòu)改變，采用免疫組織化學染色觀察小腸AQP-4、PAR-2、MAPK

4、p38蛋白表達情況，采用Bio-Plex懸液芯片技術(shù)檢測血清IL-4、IL-6、IL-10、IL-11、TNF-α、IFN-γ細胞因子的表達，采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blotting）觀察小腸AQP-4、PAR-2、MAPKp38、NF-kB、MyD88、TLR4蛋白表達。
　　3.結(jié)果
　　3.1理論探討
　　外感寒濕的致病途徑分析：寒邪、濕邪共同作用人體而致病，寒濕致病的癥狀表現(xiàn),寒濕客表則惡寒,肢厥;

5、阻于經(jīng)絡則全身關節(jié)冷痛浮腫,拘急;寒濕直中脾胃,阻滯氣機,則見濡瀉、嘔逆、胸腹痞滿。寒邪客內(nèi),阻滯氣血津液的運行可致水濕內(nèi)生,從而使原來單純的寒證變成寒濕證；濕邪阻滯陽氣日久,使陽氣損傷,以致陽氣不足,陽虛生內(nèi)寒或素體陽虛感受濕邪,亦使單純的濕證,變成寒濕之證。
　　外感寒濕致病的病機分析：
　　外感寒濕共同作用，寒傷脾陽，影響脾主運化功能；寒濕之邪進一步損傷腎陽，腎陽不足，則無力溫煦脾陽，進而加劇寒濕；寒濕之邪進一步作用于

6、人體，損傷一身之陽，陰陽痹阻、營衛(wèi)不和、體表陽氣不足，溫養(yǎng)氣化失常；寒濕之邪共同作用人體,易使氣機不暢，影響脾胃氣機，寒濕之邪郁阻三焦,水道不利。
　　3.2實驗結(jié)果
　　小鼠一般狀態(tài)觀察：正常對照組小鼠口唇紅潤，耳朵、尾巴呈淡粉色，毛發(fā)順滑有光澤，食量正常，體重逐漸增加，反應靈敏；模型組毛發(fā)食量減少，體重減輕，疏松粗糙、晦暗無光澤,同時出現(xiàn)趾(指)關節(jié)腫大、足背皮膚水腫、破潰、煩躁不安,撕咬打斗,肛周穢濁，大便不成形或稀便

7、，呼吸粗重等外濕侵襲的癥狀，取材前模型組出現(xiàn)了精神萎靡,嗜臥,懶動，神疲,關節(jié)拘急等癥狀。治療組癥狀較模型組有明顯改善，介于正常組和模型組之間。
　　小鼠體重組間比較結(jié)果：入組時，經(jīng)統(tǒng)計學處理，各組小鼠體重組間比較無差異；實驗結(jié)束時，正常組（30.42±1.72）小鼠體重高于模型組（25.64±1.29），經(jīng)統(tǒng)計學處理，有顯著性差異，P＜0.01。治療組(27.26±1.17)小鼠體重高于模型組（25.64±1.29），經(jīng)統(tǒng)計學處

8、理，有顯著性差異， P＜0.05。
　　正常組（7.23±0.72）小鼠結(jié)腸段大腸桿菌計數(shù)低于模型組（8.49±0.71），經(jīng)統(tǒng)計學處理，有顯著性差異，P＜0.05；治療組（7.24±0.36）小鼠大腸桿菌計數(shù)低于模型組（8.49±0.71），經(jīng)統(tǒng)計學處理，有顯著性差異，P＜0.05。正常組（6.23±0.94）小鼠結(jié)腸段乳酸桿菌計數(shù)高于模型組（4.66±0.41），經(jīng)統(tǒng)計學處理，有顯著性差異，P＜0.05。正常組（5.68±0.

9、69）小鼠結(jié)腸段雙歧桿菌計數(shù)高于模型組（4.99±0.47），經(jīng)統(tǒng)計學處理，有顯著性差異，P＜0.05。
　　小鼠小腸組織病理學觀察結(jié)果：光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)正常組小鼠的腸黏膜結(jié)構(gòu)完整,層次分明,腸黏膜上皮細胞的輪廓清晰,染色鮮明,排列規(guī)則。模型組小鼠的腸黏膜結(jié)構(gòu)損傷程度較重,小腸絨毛部分斷裂,上皮細胞腫脹,腸黏膜下層有炎性細胞浸潤。治療組小鼠的腸黏膜結(jié)構(gòu)損傷程度較模型組輕,小腸絨毛少部分斷裂,上皮細胞腫脹,腸黏膜下層也伴見炎性細胞浸潤

10、。
　　AQP-4、PAR-2、MAPKp38蛋白IOD值結(jié)果：正常組（20.99±2.84）、治療組（17.71±0.77）的小腸AQP-4蛋白的IOD值均明顯高于模型組（14.7±1.48），經(jīng)統(tǒng)計學處理，有顯著性差異，P＜0.01或P＜0.05。正常組（8.62±1.55）、治療組（13.22±1.19）的小腸PAR-2蛋白的IOD值均明顯低于模型組（16.76±1.21），經(jīng)統(tǒng)計學處理，有顯著性差異，P＜0.01。正常組（

11、8.62±1.55）、治療組（13.22±1.19）的小腸MAPKp38蛋白的IOD值均明顯低于模型組（16.76±1.21），經(jīng)統(tǒng)計學處理，有顯著性差異，P＜0.01。
　　小鼠血清細胞因子結(jié)果：正常組（166.95±85.56）血清IL-4含量高于模型組（70.51±22.48），經(jīng)統(tǒng)計學處理，有顯著性差異， P＜0.05。正常組（26.11±14.33）血清 IL-6含量低于模型組（69.61±33.13），經(jīng)統(tǒng)計學處理，有

12、顯著性差異，P＜0.05。正常組（73.23±26.17）血清IL-10含量高于模型組（36.14±22.48），經(jīng)統(tǒng)計學處理，有顯著性差異，P＜0.05。正常組（51.43±25.35）、治療組（80.59±34.91）血清IFN-γ含量低于模型組（138.19±58.81），經(jīng)統(tǒng)計學處理，有顯著性差異，P＜0.05。小鼠小腸組織AQP-4蛋白的表達，正常組（0.49±0.14）高于模型組（0.36±0.13），經(jīng)統(tǒng)計學處理，有顯著性

13、差異，P＜0.05。
　　蛋白免疫印跡結(jié)果：小鼠小腸組織PAR-2蛋白的表達，正常組（0.18±0.13）、治療組（0.45±0.06）低于模型組（0.52±0.24），經(jīng)統(tǒng)計學處理，有顯著性差異，P＜0.05。小鼠小腸組織MAPKp38蛋白的表達，正常組（0.12±0.08）、治療組（0.29±0.15）低于模型組（0.45±0.12），經(jīng)統(tǒng)計學處理，有顯著性差異，P＜0.05。小鼠小腸組織NF-kB蛋白的表達，正常組（0.32

14、±0.11）、治療組（0.35±0.07）低于模型組（0.54±0.11），經(jīng)統(tǒng)計學處理，有顯著性差異，P＜0.05。小鼠小腸組織MyD88蛋白的表達，正常組（0.09±0.08）低于模型組（0.32±0.12），經(jīng)統(tǒng)計學處理，有顯著性差異，P＜0.05。小鼠小腸組織TLR4蛋白的表達，正常組（0.21±0.10）低于模型組（0.44±0.16），經(jīng)統(tǒng)計學處理，有顯著性差異，P＜0.05。
　　4.結(jié)論
　　本研究從中醫(yī)理論

15、出發(fā)，結(jié)合寒邪、濕邪的致病特點，分析外感寒濕致病的病機是外感寒濕直接傷脾陽、外感寒濕進一步損傷腎陽、最終外感寒濕傷一身之陽，影響脾主運化功能和脾胃氣機，導致體內(nèi)水液代謝障礙、脾主運化功能失常等表現(xiàn)。對外感寒濕的治療要從散寒祛濕立法。
　　本研究成功建立了外感寒濕模型。模型組小鼠出現(xiàn)體重下降、腸道菌群失調(diào)、小腸炎性反應、組織結(jié)構(gòu)紊亂、水液代謝障礙、免疫系統(tǒng)紊亂等多個方面的改變，符合外感寒濕致病的病理表現(xiàn)。
　　模型組小鼠出現(xiàn)的

16、腸道菌群紊亂、小腸炎性反應、組織結(jié)構(gòu)紊亂等變化，可能是外感寒濕損傷脾陽，影響脾主運化功能的生物學基礎之一。模型組小鼠出現(xiàn)的水液代謝異常，可能是外感寒濕損傷脾陽，阻滯脾胃氣機、影響水液代謝的生物學基礎之一。模型組小鼠出現(xiàn)的免疫系統(tǒng)紊亂可能是外感寒濕損傷脾陽甚至一身之陽，影響免疫機能的生物學基礎之一。模型組小鼠上調(diào)TLR4/NF-κB信號通路的表達，可能是外感寒濕致病的分子機制之一。
　　以散寒祛濕立法的加味腎著湯改善了模型組小鼠體重