巨噬細(xì)胞耗竭對(duì)CCL4誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷與慢性肝纖維化自然恢復(fù)的影響.pdf

1、目的：研究巨噬細(xì)胞耗竭對(duì)CCL4誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷與慢性肝纖維化自然恢復(fù)的影響
　　方法：
　　1.巨噬細(xì)胞耗竭對(duì)CCL4誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷的影響：15只雄性BALB/c小鼠（23.70±2.43）g,隨機(jī)分為3組，即：對(duì)照組（ip Oil，n=5），未耗竭巨噬細(xì)胞的模型組(iv PBS,ip CCL4，n=5)，耗竭巨噬細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)組(iv Clodronate-Liposomal，CL,ip CCL4，n=5)。我們的

2、實(shí)驗(yàn)是基于Van Rooijen對(duì)氯膦酸二鈉脂質(zhì)體的報(bào)道,報(bào)道指出靜脈內(nèi)注射氯膦酸二鈉脂質(zhì)體可以選擇性的清除體內(nèi)巨噬細(xì)胞,巨噬細(xì)胞通過吞噬作用攝取脂質(zhì)體,其膦脂酶破壞脂質(zhì)體的膦脂雙分子層,藥物在細(xì)胞內(nèi)釋放從而誘導(dǎo)了巨噬細(xì)胞的凋亡。在實(shí)驗(yàn)第一天模型組小鼠于尾靜脈注射PBS150μl,實(shí)驗(yàn)組小鼠于尾靜脈注射CL150μL，對(duì)照組不做處理。尾靜脈注射12h后進(jìn)行CCL4或Oil的腹腔注射，模型組與實(shí)驗(yàn)組均腹腔注射5％CCL40.6μl/g，對(duì)

3、照組腹腔注射橄欖油（Oil）0.6μl/g。24h后處死所有小鼠，分離血清-80℃保存以備檢測(cè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Aspartate transaminase，AST）、總膽紅素（total bilirubin，TBIL）；取部分肝左葉切成條狀放入4%多聚甲醛固定，用于HE染色和免疫組織化學(xué)巨噬細(xì)胞（F4/80+）的檢測(cè)，并采用IPP圖像分析軟件檢測(cè)累積光密度

4、值（IOD）；其余肝組織切成125mm3的小塊-80℃冰箱保存，用于RT-PCR檢測(cè)一氧化氮合酶（iNos）、趨化因子16（CXCL16）的mRNA表達(dá)水平。
　　2.巨噬細(xì)胞耗竭對(duì)CCL4誘導(dǎo)的小鼠慢肝纖維化自然恢復(fù)的影響：9只雄性BALB/c小鼠（26.19±4.23）g,隨機(jī)分為3組，即對(duì)照組（ip Oil，n=3），未耗竭巨噬細(xì)胞的模型組(iv PBS,ip CCL4，n=3)，耗竭巨噬細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)組(iv CL,ip CC

5、L4，n=3)。模型組與實(shí)驗(yàn)組小鼠均進(jìn)行腹腔注射5%CCL40.6μl/g2次/周，對(duì)照組腹腔注射Oil0.6μl/g2次/周，4周后停止。停止注射CCL4后模型組小鼠于尾靜脈注射PBS150μl2次/周,實(shí)驗(yàn)組小鼠于尾靜脈注射CL150μl2次/周，對(duì)照組不做處理，一周后處死所有小鼠，分離血清-80℃保存以備檢測(cè)ALT、AST、TBIL；同樣取部分肝左葉切成條狀放入4%多聚甲醛固定，用于HE染色和天狼猩紅染色，并且用于免疫組織化學(xué)巨噬

6、細(xì)胞（F4/80+）、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、膠原蛋白-Ⅰ（collagen-Ⅰ）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF-β1）的檢測(cè)，并采用IPP圖像分析軟件檢測(cè)IOD；其余肝組織切成125 mm3的小塊-80℃冰箱保存，用于蛋白質(zhì)免疫印記（Western blot）檢測(cè)α-SMA、TGF-β1、CXCL16的蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.巨噬細(xì)胞耗竭對(duì)CCL4誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷的影響：
　　通過免疫組織化學(xué)染色可

7、見實(shí)驗(yàn)組約有80%的巨噬細(xì)胞被耗竭：應(yīng)用F4/80標(biāo)記肝臟組織中巨噬細(xì)胞，未耗竭巨噬細(xì)胞模型組于肝組織壞死區(qū)可見大量F4/80陽(yáng)性表達(dá)的巨噬細(xì)胞，其累計(jì)光密度值（ IOD）為（21496.63±5907.46），耗竭巨噬細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組肝組織中只可見極少量F4/80陽(yáng)性表達(dá)的巨噬細(xì)胞，IOD為（4404.33±311.28），對(duì)照組可見中等量F4/80陽(yáng)性巨噬細(xì)胞，IOD為（12491.26±3958.61）。模型組IOD明顯高于實(shí)驗(yàn)組，差別

8、具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。對(duì)照組IOD也高于實(shí)驗(yàn)組，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。
　　HE染色組織學(xué)觀察：模型組中肝臟中央靜脈周圍的肝細(xì)胞大量地圖樣壞死，實(shí)驗(yàn)組肝細(xì)胞壞死面積有所減少，對(duì)照組肝細(xì)胞形態(tài)正常，未見壞死區(qū)。
　　模型組血清ALT的水平（202.32±3.20）U/L,與對(duì)照組血清ALT水平（16.70±5.11）U/L相比明顯升高，差別具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。模型組血清ALT水平與實(shí)

9、驗(yàn)組血清ALT水平（200.60±6.34）U/L相比無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。模型組、實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組血清AST的水平分別為（292.90±8.64）U/L、（278.54±8.42）U/L、（64.64±30.18）U/L。與對(duì)照組血清AST水平相比模型組明顯升高，差別具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。模型組血清AST水平與實(shí)驗(yàn)組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。模型組、實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組血清TBIL的水平分別為（19.49±1

10、.16）μmol/L、（14.64±0.89）μmol/L、（6.68±0.17）μmol/L。模型組與對(duì)照組之間差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），實(shí)驗(yàn)組與模型組之間的差異也存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　RT-PCR結(jié)果示：模型組中iNos的表達(dá)高于實(shí)驗(yàn)組，其差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。且模型組iNos的表達(dá)也高于對(duì)照組，差別具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。在模型組中CXCL16的表達(dá)高于對(duì)照組，其差別具有

11、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。并且模型組CXCL16的表達(dá)也高于實(shí)驗(yàn)組，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　2.巨噬細(xì)胞耗竭對(duì)CCL4誘導(dǎo)的慢肝纖維化自然恢復(fù)的影響：
　　通過免疫組織化學(xué)染色可見實(shí)驗(yàn)組約有62%的巨噬細(xì)胞被耗竭：應(yīng)用F4/80標(biāo)記肝臟組織中巨噬細(xì)胞，模型組和對(duì)照組都可見F4/80陽(yáng)性表達(dá)的巨噬細(xì)胞，未耗竭巨噬細(xì)胞的模型組IOD為（45858.33±383.15），對(duì)照組IOD為（45209.00±746

12、6.85），耗竭巨噬細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)組肝組織中只可見極少量F4/80陽(yáng)性表達(dá)的巨噬細(xì)胞，IOD為（17810.00±7663.55），模型組IOD明顯高于實(shí)驗(yàn)組，差別具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。對(duì)照組IOD也明顯大于實(shí)驗(yàn)組，差別具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。
　　HE染色組織學(xué)觀察：模型組及實(shí)驗(yàn)組中肝臟中央靜脈周圍可見大量肝細(xì)胞壞死區(qū)，對(duì)照組肝細(xì)胞形態(tài)正常，未見壞死區(qū)。
　　天狼猩紅染色：模型組及實(shí)驗(yàn)組中均可見紅色

13、膠原沉積，模型組較少，對(duì)照組僅在匯管區(qū)可見少量陽(yáng)性表達(dá)。
　　與對(duì)照組血清ALT水平（17.73±4.49）U/L相比模型組血清ALT的水平（13.97±6.34）U/L雖然稍低，但其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。模型組血清ALT水平與實(shí)驗(yàn)組血清ALT水平（98.70±30.10）U/L相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P<0.05）。模型組、實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組血清AST的水平分別為（101.17±35.10）U/L、（202.20±35.60）U/L、（75

14、.45±4.34）U/L。與對(duì)照組血清 AST水平相比模型組血清水平無(wú)明升高，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而模型組血清AST水平與實(shí)驗(yàn)組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。模型組、實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組血清TBIL的水平分別為（6.49±0.19）μmol/L、（8.73±1.71）μmol/L、（7.29±1.16）μmol/L。三組之間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　模型組α-SMA IOD為（7850.83±1022.74），實(shí)驗(yàn)組大量表達(dá)α-SMA其I

15、OD為（13815.0±3051.69），對(duì)照組IOD為（5756.67±1218.78）僅表達(dá)在血管平滑肌中，模型組與對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。模型組與實(shí)驗(yàn)組差別存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P<0.05），對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組差別存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　模型組collagen-Ⅰ少量陽(yáng)性表達(dá)，其IOD為（9517.67±2664.57），實(shí)驗(yàn)組IOD為（25747.00±7363.58），對(duì)照組極少量陽(yáng)性表達(dá) IOD為（11009.67

16、±3272.93），對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。模型組與實(shí)驗(yàn)組同樣有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　模型組TGF-β1極少量陽(yáng)性表達(dá)，其IOD為（9523.67±3266.61），實(shí)驗(yàn)組IOD為（20536.67±5196.5），對(duì)照組幾乎呈陰性表達(dá)IOD為（8846.33±2677.30），實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。模型組與實(shí)驗(yàn)組同樣有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)果：

17、檢測(cè)α-SMA在肝組織中的表達(dá)，模型組為（0.237±0.017），實(shí)驗(yàn)組為（0.490±0.016），對(duì)照組為（0.126±0.009），分析其結(jié)果可見模型組α-SMA表達(dá)量少于實(shí)驗(yàn)組，兩組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。模型組表達(dá)量較對(duì)照組高，其差別存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　檢測(cè)TGF-β1在肝組織中的表達(dá)，模型組、實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組分別為（0.174±0.023）、（0.318±0.006）、（0.087±0.01

18、2），分析結(jié)果可見模型組表達(dá)量高于對(duì)照組，其差別存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。模型組TGF-β1表達(dá)量少于實(shí)驗(yàn)組，兩組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　檢測(cè)CXCL16在肝組織中的表達(dá)，模型組為（0.236±0.044），實(shí)驗(yàn)組為（0.393±0.015），對(duì)照組為（0.117±0.013），分析其結(jié)果可見模型組CXCL16表達(dá)量少于實(shí)驗(yàn)組，兩組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。模型組表達(dá)量較對(duì)照組高，其差別存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義