mInsB15-23H-2Kd-SCT真核表達載體對NOD小鼠T淋巴細胞亞群的影響.pdf

1、Ⅰ型糖尿病(Type1 Diabetes，T1D)是由于自身免疫耐受機制被打破而引發(fā)的自身免疫病。遺傳、環(huán)境、病毒感染、免疫功能異常等因素均能引發(fā)糖尿病。利用自身抗原在Ⅰ型糖尿病發(fā)病前期進行免疫干預，以期減緩或阻止胰島中自身免疫的過程，對T1D發(fā)揮預防作用，是目前研究的一個熱點。
　　非肥胖型糖尿病小鼠(non-obese diabetic，NOD)能自然發(fā)生Ⅰ型糖尿病，在疾病早期（3～4周齡）發(fā)生胰島炎，進行性破壞胰島β細胞，1

2、2周齡開始出現臨床癥狀，30周齡雌鼠累計發(fā)病率可達80％，是目前研究Ⅰ型糖尿病的主要動物模型。在NOD小鼠Ⅰ型糖尿病病程中，啟動抗原是胰島素(insulin)，特異性CD8+T細胞毒T細胞發(fā)揮著重要作用。InsulinB15-23（簡寫為InsB15-23）是H-2Kd限制性的優(yōu)勢表位，該抗原肽與親和力很低。為了研究InsB15-23表位在T1D病程中的作用，前期本實驗室引入了二硫鍵捕獲型單鏈三聚體技術提高InsB15-23和H-2Kd

3、的親和力，構建了膜表達型InsB15-23H-2KddtSCT(簡寫為mInsB15-23 dtSCT)真核表達載體，該載體能夠過表達mInsB15-23H-2Kd分子。用該載體和弗氏佐劑一起皮下接種3周齡NOD雌鼠，意外發(fā)現能降低NOD小鼠Ⅰ型糖尿病發(fā)病率，胰島局部單個核細胞的浸潤程度大大減輕。深入研究過表達mInsB15-23 dtSCT的免疫保護作用和闡明其具體機制，為T1D等自身免疫病的干預治療提供一個新思路。
　　在以往

4、研究的基礎上，我們試圖研究NOD小鼠過表達mInsB15-23H-2Kd產生的免疫保護作用機制，是否通過直接作用導致CTLs凋亡，減少特異性CTL數量？或者通過Th細胞亞群的分化間接影響特異性CTL數量和功能？
　　為了排除弗氏佐劑對實驗的影響，我們首先單用mInsB15-23 dtSCT真核表達載體皮下連續(xù)免疫3周齡的NOD雌鼠，連續(xù)監(jiān)測血糖，發(fā)現30周齡時平均血糖和發(fā)病率均下降，胰島炎分級評分發(fā)現實驗組胰島中單個核細胞浸潤程度

5、降低，證實單純利用mInsB15-23dtSCT真核表達載體進行早期免疫干預能夠延緩T1D疾病進程，降低發(fā)病率，對NOD鼠具有免疫保護作用。
　　CD8+T細胞和CD4+T細胞是介導T1D發(fā)生的主要效應細胞，我們重點研究過表達mIns15-23H-2Kd-SCT是否通過直接或間接作用調控T細胞亞群發(fā)揮免疫保護作用的。利用自己制備的InsB15-23dtSCT四聚體檢測NOD小鼠體內insulin特異性CD8+T細胞。Insulin

6、特異性CTL在NOD鼠3-4周齡時開始出現，隨NOD鼠周齡增加，會被其他抗原特異性CTL取代。我們在特異性InsB15-23CTL出現的時相內選取6周齡，8周齡和10周齡三個時間點分析NOD鼠體內CTL頻率，發(fā)現過表達mIns15-23H-2Kd能夠降低6周齡NOD小鼠體內特異性CTL頻率，說明過表達mInsB15-23H-2Kd能夠減少NOD小鼠特異性InsB15-23CTL數量，進而影響抗原表位擴展。通過分析NOD小鼠T1D疾病進程

7、中Th細胞的變化，我們發(fā)現過表達mInsB15-23H-2Kd的NOD鼠在糖尿病前驅期（12周齡和16周齡），體內Th1細胞頻率顯著降低，而16周齡時Th2細胞頻率增加，但整個過程具有負向調控作用的Treg細胞卻沒有明顯變化，說明接種mInsB15-23 dtSCT重組質粒能夠影響Th1細胞和Th2細胞之間的平衡，而與Treg細胞數量無關。過表達mInsB15-23H-2Kd減少NOD小鼠特異性InsB15-23CTL數量、促進Th2細