人類精子冷凍損傷的蛋白質(zhì)譜研究及差異蛋白FAM-110A的定位和功能.pdf

1、據(jù)估計(jì)，全球范圍內(nèi)有10％-20％的夫妻遭受不孕不育的困擾，其中近一半是男性不育。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，日益破壞的環(huán)境和不斷增加的生活壓力逐漸成為導(dǎo)致男性生育能力下降的主要原因。近年來(lái)，輔助生殖技術(shù)得到了長(zhǎng)足的發(fā)展，為越來(lái)越多的不育癥患者帶來(lái)了福音。這一切治療手段都基于一項(xiàng)核心技術(shù)----即精子冷凍保存技術(shù)。利用超低溫技術(shù)保存精子并且建立人類精子庫(kù)，不僅可以為患有某些不可治愈的疾病如無(wú)精癥、少弱畸精子癥的患者帶來(lái)生育的希望，同樣也為即將接受具

2、有生育毒性的治療措施的患者提供了保障。然而，精子的冷凍保存技術(shù)還有許多缺陷，人類精子在凍融后各項(xiàng)參數(shù)如活力、活率、獲能、頂體反應(yīng)等都發(fā)生了減退。目前有觀點(diǎn)認(rèn)為精子在凍融前后由于冰晶的形成，導(dǎo)致的細(xì)胞膜內(nèi)外滲透壓發(fā)生改變是造成精子結(jié)構(gòu)性損傷的原因之一，但這并不能完整解釋精子在復(fù)蘇后發(fā)生的各項(xiàng)功能減退。由于蛋白質(zhì)是機(jī)體各項(xiàng)生理活動(dòng)的直接執(zhí)行者，我們認(rèn)為著眼于精子凍融前后蛋白質(zhì)的變化有可能揭示出導(dǎo)致精子功能下降的直接原因。
　　本研究選

3、取二維凝膠電泳技術(shù)(2-D PAGE)和質(zhì)譜(MALDI-TOF)技術(shù)以便更直觀而且完整地表達(dá)精子復(fù)蘇之后的蛋白質(zhì)變化情況。通過(guò)上述技術(shù)，我們構(gòu)建了精子凍融前后差異表達(dá)的蛋白質(zhì)譜，鑒定出了27個(gè)表達(dá)差異在1.5倍以上的蛋白質(zhì)。這27個(gè)蛋白質(zhì)就有可能是導(dǎo)致精子復(fù)蘇后各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)均下降的關(guān)鍵。進(jìn)一步的研究將為臨床研制新型冷凍技術(shù)提供理論上的依據(jù)。通過(guò)查閱文獻(xiàn)資料，選取了其中一個(gè)可能直接參與精子頂體反應(yīng)以及影響受孕過(guò)程的蛋白質(zhì)FAM-110A

4、對(duì)其進(jìn)行了相關(guān)的研究。目前對(duì)于該蛋白質(zhì)家族的研究還局限于細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)方面，而在功能學(xué)方面的研究尚是空白。由于FAM-110A在哺乳動(dòng)物中廣泛表達(dá)，且高度保守，為人-小鼠同源基因，我們選擇進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以便完整地揭示該蛋白的定位與功能。后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中我們完成了對(duì)FAM-110A蛋白保守性及相關(guān)結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)與分析;通過(guò)Western blot技術(shù)以及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)完成了FAM-110A基因在小鼠各個(gè)不同組織以及不同日齡小鼠睪丸的mRNA和蛋白

5、表達(dá)分析;通過(guò)免疫熒光印記技術(shù)確定了其在細(xì)胞中的定位;最終在體外受精實(shí)驗(yàn)中明確了該蛋白的功能。綜上所述，通過(guò)對(duì)差異蛋白FAM-110A的一系列研究，我們首次闡明了一個(gè)睪丸特異性基因的功能與定位并提出以下觀點(diǎn):蛋白FAM-110A作為頂體蛋白廣泛參與精子的發(fā)生與受精過(guò)程，精子凍融后該蛋白差異表達(dá)從而導(dǎo)致復(fù)蘇精子各項(xiàng)參數(shù)異常以及受孕率顯著降低，是精子發(fā)生一系列冷凍損傷的一個(gè)重要組成部分。通過(guò)對(duì)該機(jī)制的闡述，為進(jìn)一步研究人類精子冷凍損傷的機(jī)制