高分辨人類正常精子蛋白質(zhì)2D參照圖譜的建立.pdf

1、目的：在前期工作的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步提高人類精子蛋白質(zhì)2-D電泳圖譜的分辨率，建立pH值從3.5到9.0的2-D人類正常精子蛋白質(zhì)參照圖譜。 材料和方法：收集已被證明具正常生育能力的12位志愿者的正常精液標(biāo)本，每人捐獻(xiàn)5次，所有志愿者都簽署了供精知情同意書。 運(yùn)用Pereoll密度梯度離心技術(shù)分離精子，硫脲／尿素法結(jié)合超聲法提取蛋白，2-D技術(shù)進(jìn)行人類精子蛋白質(zhì)分離。2-D第一向為固相pH梯度等電聚焦，分別使用不同pH范圍膠

2、條(pH 3-10、pH 3.5-4.5、pH 4.0-5.0、pH 4.5-5.5、pH 5.0-6.0、pH 5.5-6.7和pH6-9)。第二向為12.5％SDS-PAGE垂直電泳。圖像采用Image master5.0分析軟件分析。結(jié)合膠內(nèi)酶解和質(zhì)譜鑒定技術(shù)對不同pH范圍2-D圖譜的有關(guān)蛋白斑點(diǎn)進(jìn)行同一性身份鑒定，以此作為不同2-D圖像整合的地界標(biāo)，再由分析軟件對2-D圖譜進(jìn)行計算機(jī)處理，獲得人類正常精子蛋白質(zhì)整合參考圖譜。

3、 結(jié)果：本實驗采用了寬范圍pH(pH 3～10)，較窄范圍(pH 6-9)以及跨度為一個pH單位的重疊窄范圍(pH 3.5-4.5、 pH 4.O-5.0、pH 4.5-5.5、pH 5.0-6.0和pH 5.5-6.7)固相膠條，用Imagemaster 5.O分析軟件分別對所有pH范圍的2.D圖譜進(jìn)行蛋白點(diǎn)的檢測，在相同檢測參數(shù)下，在所有pH范圍的2．D圖譜上的檢測到的點(diǎn)分別為：1306(pH 3-10)、168(pH 3.5

4、-4.5)、572(pH 4.O-5.0)、1463(pH 4.5-5.5)、1370(pH 5.0-6.0)、1121(pH 5.5-6.7)和1061(pH 6-9)。選取適當(dāng)?shù)牡鞍c(diǎn)當(dāng)作計算機(jī)合成參照圖譜的地界標(biāo)進(jìn)行酶解以及質(zhì)譜分析。用軟件刪除重復(fù)的蛋白，最后合成了一張pH值從3.5到9.0的具有3872點(diǎn)人類正常精子蛋白質(zhì)的2-D參照圖，蛋白點(diǎn)的數(shù)目將近是pH 3-10 2-D圖譜上蛋白的3倍。 結(jié)論：本實驗首次獲得了人