高分辨人類正常精子蛋白質2D參照圖譜的建立.pdf

1、目的：在前期工作的基礎上，進一步提高人類精子蛋白質2-D電泳圖譜的分辨率，建立pH值從3.5到9.0的2-D人類正常精子蛋白質參照圖譜。 材料和方法：收集已被證明具正常生育能力的12位志愿者的正常精液標本，每人捐獻5次，所有志愿者都簽署了供精知情同意書。 運用Pereoll密度梯度離心技術分離精子，硫脲／尿素法結合超聲法提取蛋白，2-D技術進行人類精子蛋白質分離。2-D第一向為固相pH梯度等電聚焦，分別使用不同pH范圍膠

2、條(pH 3-10、pH 3.5-4.5、pH 4.0-5.0、pH 4.5-5.5、pH 5.0-6.0、pH 5.5-6.7和pH6-9)。第二向為12.5％SDS-PAGE垂直電泳。圖像采用Image master5.0分析軟件分析。結合膠內酶解和質譜鑒定技術對不同pH范圍2-D圖譜的有關蛋白斑點進行同一性身份鑒定，以此作為不同2-D圖像整合的地界標，再由分析軟件對2-D圖譜進行計算機處理，獲得人類正常精子蛋白質整合參考圖譜。

3、 結果：本實驗采用了寬范圍pH(pH 3～10)，較窄范圍(pH 6-9)以及跨度為一個pH單位的重疊窄范圍(pH 3.5-4.5、 pH 4.O-5.0、pH 4.5-5.5、pH 5.0-6.0和pH 5.5-6.7)固相膠條，用Imagemaster 5.O分析軟件分別對所有pH范圍的2.D圖譜進行蛋白點的檢測，在相同檢測參數下，在所有pH范圍的2．D圖譜上的檢測到的點分別為：1306(pH 3-10)、168(pH 3.5

4、-4.5)、572(pH 4.O-5.0)、1463(pH 4.5-5.5)、1370(pH 5.0-6.0)、1121(pH 5.5-6.7)和1061(pH 6-9)。選取適當的蛋白點當作計算機合成參照圖譜的地界標進行酶解以及質譜分析。用軟件刪除重復的蛋白，最后合成了一張pH值從3.5到9.0的具有3872點人類正常精子蛋白質的2-D參照圖，蛋白點的數目將近是pH 3-10 2-D圖譜上蛋白的3倍。 結論：本實驗首次獲得了人