ALX1誘導(dǎo)EMT促進(jìn)肺癌侵襲和遷移的機(jī)制以及β-欖香烯的逆轉(zhuǎn)作用研究.pdf

1、本文主要從以下幾方面進(jìn)行了論述：
　　第一部分 ALX1在肺癌中的表達(dá)研究
　　目的:比較ALX1在肺癌組織中表達(dá)差異情況，揭示ALX1表達(dá)水平與肺癌惡性程度以及預(yù)后的關(guān)系。
　　方法:通過Real time-PCR實(shí)驗(yàn)考察47例肺癌組織和癌旁組織樣本中ALX1mRNA的表達(dá)水平;利用免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)考察發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌組織和未轉(zhuǎn)移的肺癌組織中ALX1蛋白的表達(dá)水平;利用Kaplan-Meier生存分析研究ALX1

2、的表達(dá)水平與肺癌病人的預(yù)后情況。
　　結(jié)果:1.47例肺癌組織均表達(dá)ALX1，且顯著高于癌旁組織樣本中ALX1 mRNA的表達(dá)水平。2.47例肺癌組織中，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌組織的ALX1 mRNA的表達(dá)水平顯著高于未轉(zhuǎn)移的肺癌組織。3.免疫組化分析顯示，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌組織中ALX1陽性細(xì)胞比例要顯著高于未轉(zhuǎn)移的肺癌組織中ALX1陽性細(xì)胞的比例。4.ALX1表達(dá)水平較低的肺癌患者的生存期顯著長于ALX1高表達(dá)組。
　　

3、結(jié)論:ALX1在肺癌組織中特異性高表達(dá)，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌組織中表達(dá)水平更高。ALX1高表達(dá)縮短肺癌患者的生存期。
　　第二部分 構(gòu)建ALX1過表達(dá)和基因沉默細(xì)胞系
　　目的:構(gòu)建ALX1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和基因沉默的細(xì)胞模型，為ALX1調(diào)控肺癌細(xì)胞侵襲和遷移的分子機(jī)制研究提供工具。
　　方法:通過Real time-PCR實(shí)驗(yàn)考察8種肺癌細(xì)胞系中ALX1 mRNA的表達(dá)水平。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)構(gòu)建過表達(dá)人ALX1的H1975

4、細(xì)胞模型，應(yīng)用shRNA技術(shù)沉默H460細(xì)胞中ALX1的表達(dá)。通過Western blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證模型構(gòu)建情況，采用MTT實(shí)驗(yàn)觀察構(gòu)建細(xì)胞模型的增殖能力，并觀察模型細(xì)胞的形態(tài)變化。通過Western blot實(shí)驗(yàn)和免疫熒光實(shí)驗(yàn)考察ALX1誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞EMT情況。
　　結(jié)果:1.8種肺癌細(xì)胞系中ALX1表達(dá)水平各異，H1975細(xì)胞表達(dá)較低，而H460細(xì)胞表達(dá)較高，適用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染研究。2.成功構(gòu)建了ALX1-pBabe-H1975細(xì)胞

5、模型和ALX1-siRNA-H460細(xì)胞模型，Western blot實(shí)驗(yàn)顯示過表達(dá)ALX1后，H1975細(xì)胞ALX1蛋白表達(dá)水平顯著高于mock-H1975和pBabe-H1975細(xì)胞;三組ALX1siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，ALX1蛋白表達(dá)水平顯著低于對照細(xì)胞。3.MTT結(jié)果表明，過表達(dá)ALX1后，ALX1-pBabe-H1975細(xì)胞的增殖顯著快于對照細(xì)胞;沉默ALX1后，ALX1-siRNA-H460細(xì)胞的增殖能力下降。4.過表達(dá)ALX

6、1后，ALX1-pBabe-H1975細(xì)胞呈現(xiàn)間質(zhì)細(xì)胞樣改變;沉默ALX1后，ALX1-siRNA-H460細(xì)胞呈現(xiàn)上皮樣細(xì)胞形態(tài)。5.過表達(dá)ALX1后，ALX1-pBabe-H1975細(xì)胞上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白E-cadherin和α-catenin表達(dá)降低，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白Vimentin和N-cadherin表達(dá)上調(diào);沉默ALX1后，ALX1-siRNA-H460細(xì)胞E-cadherin和α-catenin表達(dá)上調(diào)，而Vimentin和

7、N-cadherin表達(dá)降低。免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。
　　結(jié)論:成功構(gòu)建了ALX1-pBabe-H1975和ALX1-siRNA-H460細(xì)胞模型，并成功運(yùn)用于ALX1誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞EMT的研究。
　　第三部分 ALX1誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞EMT的機(jī)制研究
　　目的:分析ALX1誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞EMT的分子機(jī)制，揭示ALX1誘導(dǎo)EMT對肺癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響。
　　方法:利用構(gòu)建的ALX1高

8、表達(dá)和基因沉默細(xì)胞模型，通過Transwell和基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)、Real time-PCR實(shí)驗(yàn)、Western blot實(shí)驗(yàn)和熒光素酶實(shí)驗(yàn)考察ALX1誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞EMT的分子機(jī)制。
　　結(jié)果:1.過表達(dá)ALX1增加ALX1-pBabe-H1975細(xì)胞通過Transwell膜和基質(zhì)膠的數(shù)量，侵襲和遷移能力增強(qiáng)。沉默ALX1后，ALX1-siRNA-H460細(xì)胞侵襲和遷移能力減弱。2.過表達(dá)ALX1不影響ALX1-pBabe-H197

9、5細(xì)胞中ZEB1、Slug和Twist的mRNA和蛋白表達(dá)，顯著提高Snail的mRNA和蛋白表達(dá)水平。沉默ALX1后，ALX1-siRNA-H460細(xì)胞Snail的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)。3.過表達(dá)ALX1顯著提高H1975細(xì)胞中熒光素的強(qiáng)度。沉默ALX1后，ALX1-siRNA-H460細(xì)胞熒光素強(qiáng)度顯著下降。4.沉默Snail后，ALX1-pB abe-H1975細(xì)胞中低水平的E-cadherin和α-catenin表達(dá)恢

10、復(fù)，而高水平的Vimentin和N-cadherin表達(dá)下降;穿透基質(zhì)膠和Transwell膜的細(xì)胞個(gè)數(shù)減少。
　　結(jié)論:ALX1通過Snail誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞EMT，增強(qiáng)肺癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。這些發(fā)現(xiàn)為ALX1作為潛在治療靶點(diǎn)的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。
　　第四部分 β-欖香烯逆轉(zhuǎn)ALX1誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞EMT的機(jī)制研究
　　目的:考察β-欖香烯對ALX1誘導(dǎo)的EMT的影響，揭示β-欖香烯逆轉(zhuǎn)肺癌EMT的分子機(jī)制。

11、　　方法:利用構(gòu)建的ALX1高表達(dá)細(xì)胞模型，通過MTT、Transwell侵襲、Transwell遷移實(shí)驗(yàn)和Western blot實(shí)驗(yàn)、免疫熒光實(shí)驗(yàn)考察β-欖香烯對ALX1誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞EMT的影響和機(jī)制。
　　結(jié)果:1.β-欖香烯處理后，ALX1過表達(dá)的ALX1-pBabe-H1975細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)上皮樣改變，增殖速度減慢。2.β-欖香烯處理后，通過Transwell膜和基質(zhì)膠的ALX1-pBabe-H1975細(xì)胞數(shù)量減少，ALX

12、1-pBabe-H1975細(xì)胞侵襲和遷移能力減弱。3.Western blot實(shí)驗(yàn)表明β-欖香烯上調(diào)ALX1過表達(dá)的ALX1-pBabe-H1975細(xì)胞的E-cadherin和α-catenin，下調(diào)Vimentin和N-cadherin。免疫熒光分析發(fā)現(xiàn)E-cadherin熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，而N-cadherin強(qiáng)度減弱。4.β-欖香烯降低ALX1-pBabe-H1975細(xì)胞Snail的蛋白水平。
　　結(jié)論:β-欖香烯抑制Snail