薯蕷皂苷抗肝腦缺血再灌注損傷的生物學(xué)活性及分子機(jī)制研究.pdf

1、目的:考察薯蕷皂苷(dioscin)抗肝腦缺血再灌注損傷的生物學(xué)活性并探討可能的分子作用機(jī)制。
　　方法:(1)在薯蕷皂苷抗肝缺血再灌注損傷(hepatic I/R injure)研究中，采用70％Wistar大鼠肝缺血模型。預(yù)防組大鼠隨機(jī)分假手術(shù)組、模型組和高中低劑量給藥組(薯蕷皂苷，60、40和20 mg/kg)，每組10只，每天口服給予薯蕷皂苷1次，連續(xù)給藥7天;治療組大鼠隨機(jī)分假手術(shù)組、模型組和給藥組(薯蕷皂苷，60 mg

2、/kg)，每組20只，手術(shù)前2h口服給予薯蕷皂苷1次，術(shù)后每天給藥一次。檢測(cè)血清ALT、AST水平，結(jié)合組織病理學(xué)和生存率等指標(biāo)來評(píng)價(jià)薯蕷皂苷對(duì)肝缺血再灌注損傷的保護(hù)作用;測(cè)定肝組織中SOD、MDA、CAT、GSH-Px、 GSH、NO、iNOS和TNOS含量來考察薯蕷皂苷的抗氧化能力;采用DAPI、TUNEL和DAB分析法考察薯蕷皂苷的抗凋亡作用;采用免疫組織化學(xué)、western blotting及real-time PCR方法考察薯

3、蕷皂苷對(duì)凋亡和炎癥信號(hào)通路相關(guān)蛋白和基因表達(dá)影響。
　　(2)在薯蕷皂苷抗腦缺血再灌注損傷(cerebral I/R injure)研究中，體外建立PC12細(xì)胞和原代神經(jīng)元細(xì)胞的OGD/R模型，薯蕷皂苷(200、100和50 ng/mL)預(yù)處理12h，用MTT法、LDH、NeuN的釋放測(cè)定來評(píng)價(jià)薯蕷皂苷對(duì)OGD/R損傷細(xì)胞的保護(hù)作用;體內(nèi)建立SD大鼠MCAO的腦缺血再灌注模型，預(yù)防組大鼠隨機(jī)分假手術(shù)組、模型組和薯蕷皂苷高中低劑量給

4、藥組(60、40和20 mg/kg)，每組10只，每天口服給予薯蕷皂苷1次，連續(xù)給藥7天;治療組大鼠隨機(jī)分假手術(shù)組、模型組和薯蕷皂苷高中低劑量給藥組(60、40和20 mg/kg)，每組10只，建立MCAO模型前2h口服給予薯蕷皂苷1次，術(shù)后每天給藥一次;以預(yù)防組的神經(jīng)功能缺損評(píng)分、大腦TTC染色、大腦相關(guān)指數(shù)、大腦組織LDH釋放水平、組織病理學(xué)、大腦細(xì)胞標(biāo)志物(NeuN、GFAP和Kir4.1)測(cè)定和TUNEL檢測(cè)，以及治療組的神經(jīng)功

5、能缺損評(píng)分和生存率來評(píng)價(jià)薯蕷皂苷對(duì)MCAO大鼠的腦保護(hù)作用;采用westernblotting及Real-time PCR方法考察薯蕷皂苷對(duì)大腦中涉及HMGB-1/TLR4炎癥信號(hào)通路相關(guān)的蛋白和基因表達(dá)影響;并采用HMBG-1、TLR4 siRNA干擾和全基因過表達(dá)實(shí)驗(yàn)分別驗(yàn)證薯蕷皂苷是否是通過抑制HMGB-1/TLR4信號(hào)通路抗腦缺血再灌注損傷。
　　結(jié)果:(1)在抗肝缺血再灌注損傷實(shí)驗(yàn)中，預(yù)防組實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，薯蕷皂

6、苷能顯著降低血清ALT和AST活性，減輕由肝缺血再灌注損傷導(dǎo)致的肝組織損傷;治療組實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，薯蕷皂苷(60 mg/kg)能顯著降低不同時(shí)間點(diǎn)血清ALT和AST酶活性，提高大鼠生存率。同時(shí)，薯蕷皂苷可顯著降低MDA、iNOS、TNOS、NO含量，升高GSH、GSH-Px、SOD、CAT水平，改善氧化應(yīng)激，并能夠減少TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)，減輕肝細(xì)胞的凋亡;分子機(jī)制研究表明薯蕷皂苷能夠降低MAPKs磷酸化水平，下調(diào)CYP2E1、

7、IL-1β、IL-6、TNF-α、ICAM-1、MIP-1α、MIP-2、NF-κB、AP-1、COX-2和HMGB-1等炎癥因子的基因或蛋白表達(dá)水平，降低PARP、Caspase-9、Caspase-3、Bak、p53、Fas和FasL等凋亡蛋白或基因表達(dá)水平，上調(diào)Bcl-2和Bcl-x的蛋白表達(dá)水平。
　　(2)在抗腦缺血再灌注損傷的實(shí)驗(yàn)中，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與OGD/R模型組相比，薯蕷皂苷能顯著升高PC12和原代神經(jīng)元的細(xì)胞活力

8、，減少LDH釋放，增加原代神經(jīng)元的NeuN釋放;體內(nèi)預(yù)防實(shí)驗(yàn)中，與模型組相比，薯蕷皂苷能顯著改善MCAO大鼠的大腦神經(jīng)功能缺損評(píng)分、減少TTC染色陽性區(qū)域、大腦LDH釋放水平、大腦相關(guān)指數(shù)以及大腦組織的GFAP、Kir4.1和TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)，增加腦組織NeuN陽性細(xì)胞數(shù);體內(nèi)治療實(shí)驗(yàn)中，與模型組相比，薯蕷皂苷可以改善MCAO大鼠的大腦神經(jīng)功能缺損評(píng)分，提高大鼠生存率。分子機(jī)制研究表明薯蕷皂苷抗腦缺血再灌注損傷是通過抑制HMGB-1

9、的核轉(zhuǎn)移，降低HMGB-1蛋白表達(dá)水平，從而抑制TLR4炎癥信號(hào)通路的相關(guān)蛋白NF-κB、AP-1、MAPKs、p-STAT3和炎癥因子;進(jìn)一步的HMGB-1、TLR4 siRNA和全基因過表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明薯蕷皂苷抗腦缺血再灌注損傷的作用靶點(diǎn)是HMGB-1/TLR4信號(hào)通路。
　　結(jié)論:(1)薯蕷皂苷是通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激水平、抗炎和抗凋亡等途徑來實(shí)現(xiàn)抗肝缺血再灌注損傷的生物學(xué)作用;(2)薯蕷皂苷有較好的抗腦缺血再灌注損傷作用，這種作