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文檔簡介
1、目的:
各種損傷因素所導(dǎo)致的急慢性皮膚創(chuàng)傷是臨床最常見的疾患之一。創(chuàng)傷治療的目的是清創(chuàng)后采用有效手段促進(jìn)創(chuàng)面盡快愈合,恢復(fù)受損組織的功能。已知,創(chuàng)面愈合是皮膚受損組織通過十分復(fù)雜但又有序的自我修復(fù)機(jī)制使整個創(chuàng)面恢復(fù)原貌的過程。研究表明,皮膚損傷修復(fù)過程不但存在皮膚內(nèi)各細(xì)胞組分的增殖還有賴于一系列緊密聯(lián)系的生化和分子生物學(xué)的級聯(lián)反應(yīng)。這些分子機(jī)制逐一和遞次地出現(xiàn)在皮膚損傷修復(fù)的四個階段,即止血,炎癥反應(yīng),細(xì)胞增殖和塑形,最終實(shí)現(xiàn)
2、皮膚創(chuàng)面如期修復(fù)愈合;換言之,正是損傷修復(fù)相關(guān)因子推動了損傷修復(fù)的進(jìn)程。因此,深入認(rèn)識損傷修復(fù)的分子機(jī)制,進(jìn)而采取有效的治療手段調(diào)節(jié)修復(fù)促進(jìn)因子的表達(dá)和產(chǎn)生具有重要的理論價值和臨床意義。同時,對損傷修復(fù)促進(jìn)因子(因素)的上調(diào)作用正在成為評價創(chuàng)傷治療效果的重要指標(biāo)。
長期的臨床實(shí)踐證實(shí),將醫(yī)用絲光綠蠅蛆蟲(簡稱五谷蟲)放置于創(chuàng)面表面可以對創(chuàng)面起到祛腐清創(chuàng)的作用。這一治療方法尤其適用于感染及壞死較為嚴(yán)重的慢性創(chuàng)面和潰瘍的治療。盡管
3、五谷蟲具有吞噬和去除污染及感染組織的作用,但由于主客觀的原因并非所有患者都能夠接受這種治療方法;另外,蛆蟲短暫的成熟期使它們很快變蛹失去效用。近期研究發(fā)現(xiàn),五谷蟲促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用不僅是通過吞噬感染組織,其分泌和排泄物中也含有一些有益于抗菌和促進(jìn)細(xì)胞生長的生物活性物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn),五谷蟲蟲體本身具有很強(qiáng)的自我修復(fù)能力,從而進(jìn)一步說明五谷蟲蟲體細(xì)胞中含有促損傷修復(fù)的細(xì)胞因子/生長因子,借助有效生物技術(shù)提取的蟲體蛋白有可能是治療皮膚創(chuàng)傷尤其是
4、慢性損傷和不愈合創(chuàng)面的潛在生物制劑。不過,目前有關(guān)這方面的研究還鮮見報道。
如前所述,損傷修復(fù)有賴于皮膚組織中各細(xì)胞組分的分裂、增殖、游走和新生血管形成,而這些細(xì)胞分子生物學(xué)現(xiàn)象受到某些生長因子的調(diào)控。這些生長因子以協(xié)調(diào)和互補(bǔ)的方式共同促進(jìn)損傷愈合的進(jìn)程,它們包括表皮生長因子/EGF,轉(zhuǎn)化生長因子/TGF家族蛋白,成纖維細(xì)胞生長因子/FGF,肝細(xì)胞生長因子/HGF和血小板衍生生長因子/PDGF等。進(jìn)一步的研究表明,這些因子作為
5、分子信號主要通過特定的或由其它蛋白介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)通路將信息傳遞到細(xì)胞核內(nèi),通過調(diào)節(jié)諸如c-Myc,Bcl-2,survivin,cyclinD1和VEGF等基因的表達(dá)發(fā)揮其損傷修復(fù)促進(jìn)作用。大量研究證實(shí),Wnt, STAT3,TGF-beta-Smad2/3,NF-κB和Notch等信號通路參與了損傷修復(fù)和組織再生的過程。盡管五谷蟲及其提取物的促損傷修復(fù)的效果得到證實(shí),但其作用的分子機(jī)制尤其是對上述生長因子,信號通路以及通路下游基因表達(dá)的影
6、響迄今尚無報道。闡明上述問題將為五谷蟲制劑的實(shí)際應(yīng)用提供科學(xué)的依據(jù),因此成為本課題的研究目的。
五谷蟲本身,其分泌/排泄物以及蟲體提取物都有一定的損傷修復(fù)促進(jìn)作用,但目前還不清楚哪些組分發(fā)揮更大的作用。因此,在相同的動物體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)條件下觀察這些組分的促進(jìn)損傷修復(fù)的功效以及它們對損傷修復(fù)相關(guān)因子/信號通路的影響能夠科學(xué)地回答這個問題,也有助于五谷蟲提取物的合理使用與配制。這也成為本博士論文的另一個立題依據(jù)。
方法:
7、
一.五谷蟲樣品制備:蛆蟲分泌/排泄物:蛆蟲經(jīng)常規(guī)處理后收集。20克冰凍蛆體,切成薄片,總蛋白提取,實(shí)驗(yàn)動物共設(shè)4組(8只/組):組1:凡士林軟膏涂抹;組2:分泌/排泄物(Secretion/excretion; S/E);組3:吐后蛆體裂解液(Extract+S/E);組4:未吐蛆體裂解液處理(Extract-S/E)。二.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分:1.動物選擇與飼養(yǎng)條件:取健康成年雄性SD大鼠32只,隨機(jī)分成4組(8只/組)。飼養(yǎng)于2
8、5℃,相對濕度為40%~70%環(huán)境下,每天接受自然光照9小時,由飲食飲水。2.損傷模型的建立:麻醉藥腹內(nèi)注射麻醉后,去毛劑脫毛:無菌下在背部造成2個直徑為1.5cm的圓形全層皮膚開放創(chuàng)面。造模動物不用抗生素及抗凝劑。3.愈合情況觀察:于造模后第1、3、5、7、9、12、14和16天觀察創(chuàng)面的色澤、腫脹程度、表面滲液、肉芽組織生長和表皮增生修復(fù)情況。用透明膜創(chuàng)面記錄表描畫創(chuàng)面外緣。
結(jié)果:
第一部分 三種五谷蟲提取物的
9、制備及產(chǎn)出量和質(zhì)量分析
1.五谷蟲提取物的制備量和濃度:使用280nm的紫外分光光度計測出OD值,計算出不含五谷蟲分泌物/排泄物的五谷蟲蟲體組(20克),含分泌物/排泄物的五谷蟲蟲體組(20克)和由20克五谷蟲分泌和排泄的混合物中的蛋白濃度,它們的含量分別是89.85mg(5.99μg/μl;5990μg/ml),88.05 mg(5.87μg/μl;5870μg/ml)和9 mg(0.6μg/μl;600μg/ml)。
10、> 2.五谷蟲提取物組成成分分析:10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果顯示:兩組蟲體提取物所含蛋白的分子量大小范圍從7 kDa到210 kDa,蛋白譜型基本一致,蛋白的條帶清晰,無拖尾降解現(xiàn)象但分泌/排泄后蟲體提取物的蛋白條帶略弱一些;分泌物/排泄物混合物未見大分子蛋白,條帶的分子量小于7 kDa。
3.采用新方法制備五谷蟲提取物縮短了制備時間:采用本文介紹的方法可在不到5分鐘即可完成五谷蟲粗提物的制各且操作過程十分簡捷。
11、r> 4.高濃度五谷蟲分泌的收集:采用本文收集方法可獲得濃度為600μg/ml甚至更高的混合物,使不經(jīng)濃縮甚至需稀釋后用于體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)成為可能。
第二部分 改良的透明膜測量法在計算大鼠皮膚損傷愈合率中的應(yīng)用
1.高通量的信息采集:按觀測不同的時間,組別和大鼠編號將所測創(chuàng)面簡潔、整齊和有序的(一個創(chuàng)面的不同觀察日標(biāo)記信息“圈套圈”的形式)集成到本課題設(shè)計的一張長方形透明膜上。由于實(shí)驗(yàn)?zāi)┢诘囊恍?shí)驗(yàn)組的創(chuàng)面提前愈合,
12、所以在整個實(shí)驗(yàn)過程中總共在一張透明膜上記錄和收集了243個而非256個創(chuàng)面邊緣描記圖像。而傳統(tǒng)的透明膜測量方法是按預(yù)計觀測次數(shù)與創(chuàng)面數(shù)量準(zhǔn)備足夠數(shù)量的整張面積大于造模面積的正方形透明膜,并在每張透明膜上標(biāo)明觀測時間,組別和大鼠序號。因此,信息采集過程十分繁瑣、費(fèi)時和凌亂。
2.透明膜標(biāo)記信息的精確和高效處理:將含有243個創(chuàng)面邊緣描記圖像的透明膜經(jīng)掃描儀掃描入電腦并保存后,利用Adobe Photoshop CS4 site圖
13、像分析軟件工具欄中磁性套圈選項(xiàng)描記創(chuàng)面邊緣,點(diǎn)擊直方圖項(xiàng)(圖2C)查看創(chuàng)面像素值,并將像素值填在excel表中,對每個標(biāo)記信息的測量平均用時在27秒以內(nèi)。因此,在2小時之內(nèi)便可獲得所有觀測日包(括首日)全部243個創(chuàng)面的像素值和面積。
結(jié)論:
1.采用本課題組獨(dú)特的蛋白提取和分泌/排泄物收集方法,高產(chǎn)出,高質(zhì)量地制備出三種五谷蟲提取物,為下一步的實(shí)驗(yàn)研究提供了可靠的保證。
2.建立和完善了透明膜創(chuàng)面面積標(biāo)記
14、和測量法并在精確計算大鼠皮膚損傷愈合率中應(yīng)用,獲得了可靠的數(shù)據(jù),取得了更為精確的測量結(jié)果。
3.基于透明膜創(chuàng)面面積標(biāo)記和測量法的檢測結(jié)果顯示,含有分泌/排泄的,分泌/排泄后的五谷蟲蟲體提取物以及分泌/排泄混合物對大鼠皮膚損傷均有促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用且前者的作用更為明顯。這提示,在五谷蟲蟲體及其分泌/排泄混合物中都含有損傷修復(fù)促進(jìn)因子。因此,在實(shí)踐中使用未經(jīng)分泌/排泄的蟲體提取物可能取得更好的治療效果。
4.中低濃度的五
15、谷蟲提取物對人角質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用,但濃度較高時則抑制細(xì)胞生長甚至具有殺傷性。這種現(xiàn)象表明,五谷蟲提取物具有較強(qiáng)生物活性,因此在使用前應(yīng)該掌握其最佳使用濃度,以避免可能產(chǎn)生的不良反應(yīng)。
5.對僅用凡士林處理和五谷蟲提取物處理創(chuàng)面的檢測結(jié)果顯示,提取物處理對創(chuàng)面組織內(nèi)NF-κB,Wnt2/β-catenin和Notch通路的狀態(tài)無明顯影響,說明這三個通路未必是提取物作用的對象;換言之,后者對修復(fù)的促進(jìn)作用不是借助
16、這三個通路來實(shí)現(xiàn)。
6.TGF-β/Smad3通路是公認(rèn)的損傷修復(fù)促進(jìn)因素而STAT3通路的活化能夠上調(diào)一系列細(xì)胞增殖促進(jìn)基因的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示,五谷蟲提取物處理后的大鼠皮膚組織和人角質(zhì)及成纖維細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)這兩個通路的活化程度明顯提高,從而提示上述兩個通路的活化在五谷蟲提取物促進(jìn)損傷修復(fù)過程中可能發(fā)揮重要的作用。
7.RNA和蛋白質(zhì)的檢測結(jié)果顯示,五谷蟲提取物處理的組織和細(xì)胞中這三個基因的表達(dá)明顯上調(diào)。由于NF-κ
17、B,Wnt2/β-catenin,Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在被檢組織和細(xì)胞內(nèi)活化程度較低或處于不活化的狀態(tài),而TGF-β/Smad3通路在一定程度上對c-Myc表達(dá)有負(fù)性調(diào)節(jié)作用,故認(rèn)為c-Myc,cyclin D1 and VEGF表達(dá)上調(diào)很可能是STAT3通路活化的結(jié)果。TGF-β/Smad3和STAT3對c-Myc表達(dá)的雙向調(diào)節(jié)則提示,兩者在多階段損傷修復(fù)過程中可能存在某種互動和功能交替,在生物功效上也許處于動態(tài)平衡。這一點(diǎn)有待下一
18、步研究證明。
創(chuàng)新性:
本課題首次采用嶄新的創(chuàng)面信息采集和創(chuàng)面面積測算技術(shù)評估并證實(shí)三種五谷蟲提取物對大鼠皮膚損傷修復(fù)的促進(jìn)作用。首次以主要的損傷修復(fù)相關(guān)信號通路及其下游靶基因作為切入點(diǎn),以大鼠皮膚創(chuàng)面作為體內(nèi)模型,人角質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞作為體外實(shí)驗(yàn)?zāi)P停到y(tǒng)地分析了五谷蟲提取物促進(jìn)損傷修復(fù)的分子機(jī)制并得出較為肯定的結(jié)論。本課題獲得的研究結(jié)果為五谷蟲提取物的高質(zhì)量制備,科學(xué)合理的使用和療效評價提供了新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)
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