江南卷柏提取物的純化分析及其對皮膚傷口愈合作用的研究.pdf

1、江南卷柏能夠清熱利尿，活血消腫，可用于治療包括急性傳染性肝炎，血小板減少，全身浮腫等。已知江南卷柏主要的化學(xué)成分是黃酮類，其中穗花杉雙黃酮含量最高。在蕨類植物中和裸子植物中，存在大量的黃酮單體化合物，尤其是在松柏綱，銀杏綱和風(fēng)尾綱的植物中含量最多，而黃酮類具有廣泛的藥理活性。
　　皮膚是保護(hù)人體與外界有害環(huán)境隔絕的第一道防線。當(dāng)人受到傷害過后，傷口會迅速止血，閉合，受損的皮膚會迅速再生，從而再次起到屏障作用。有效的皮膚傷口愈合需要

2、很多種細(xì)胞參與，并且這一過程是在不同層面被精確的調(diào)控。傷口愈合的過程主要可以分為四個時期，包括止血期（在受損后數(shù)個小時之內(nèi)），炎癥期（受損后1-3天），增殖期（受損后4-21天），重塑期（受損后21天-1年）。在正常傷口愈合過程中，成纖維細(xì)胞具有重要作用。在人類不同組織中，成纖維細(xì)胞的類群并不一樣，并且在一個特定的組織中，也有明顯的不同。例如在人皮膚真皮層中，在不同的皮膚層居住著不同類型的成纖維細(xì)胞類群，這些細(xì)胞具有各自獨特的形態(tài)以及生

3、理功能。
　　結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF，CCN2)是CCN家族(CCN1-6)的一員。結(jié)締組織生長因子的功能研究最開始是因為發(fā)現(xiàn)其在過量的胞外基質(zhì)合成中具有重要作用，并與一些纖維化疾病相關(guān)。結(jié)締組織生長因子在正常皮膚組織中并不經(jīng)常表達(dá)，但是當(dāng)皮膚受到損傷過后，結(jié)締組織生長因子的表達(dá)會升高，并能促進(jìn)成纖維細(xì)胞表達(dá)膠原蛋白Ⅰ，膠原蛋白Ⅲ，組織抑制因子MMP和基礎(chǔ)的FGF

4、，但是并不影響蛋白聚糖的表達(dá)。雖然結(jié)締組織生長因子并不影響肌成纖維細(xì)胞的分化，但是它被認(rèn)為具有促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞遷移到傷口并分化成表皮成纖維細(xì)胞的能力。另外，結(jié)締組織生長因子能夠通過整合素α5β1促進(jìn)角質(zhì)細(xì)胞在傷口愈合過程中遷移到傷口處。
　　江南卷柏具有止血消腫等諸多藥效，本課題擬對江南卷柏全草進(jìn)行水溶性成分和脂溶性成分提取，然后采用一系列分離提純的方法純化獲得其有效成分，并對獲得的組分進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，并分析其對皮膚傷口愈合的作用。

5、江南卷柏水溶性成分提取采用熱水浸提法，脂溶性成分提取采用乙醇回流法，粗提物通過大孔樹脂吸附，RC18硅膠柱和Sephadex LH-20進(jìn)行分離，采用制備型HPLC進(jìn)行最后的純化制備。分離獲得的化合物結(jié)構(gòu)分析方法包括紫外吸收光譜，紅外吸收光譜，核磁共振NMR分析，HPLC-ESI-MS，酸水解分析，旋光度測試，不飽和度分析等。提純獲得的化合物的功能主要通過體內(nèi)體外的研究方法，分析其與皮膚傷口的愈合作用關(guān)系，體外研究包括測試其對NIH3T

6、3增殖遷移的促進(jìn)的效果，并通過熒光定量PCR，Western blot分析其作用機(jī)制，體內(nèi)實驗擬采用SD大鼠切割傷傷口愈合模型，測定江南卷柏純化產(chǎn)物對SD大鼠皮膚傷口愈合的作用。
　　本課題對江南卷柏脂溶性成分以及水溶性成分進(jìn)行了提取分離，并成功分離提純得到了兩個化合物，水溶性提取物A和脂溶性提取物B。
　　水溶性提取物A是一種黃色的不定形粉末。將江南卷柏全草去根過后，曬干，然后采用中藥粉碎機(jī)充分粉碎然后稱取15kg烘干過后

7、的江南卷柏樣品，采用95％乙醇進(jìn)行回流脫脂過后，剩余殘渣采用雙蒸水進(jìn)行浸提，采用100L雙蒸水浸提三次，每次浸提4h，將提取液合并，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮凍干后得到江南卷柏水溶性提物1552g。將水溶性提取物用熱稀醇進(jìn)行充分溶解，然后上樣到D101型大孔樹脂進(jìn)行吸附，再采用不同濃度的乙醇進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫液并進(jìn)行濃縮，濃縮產(chǎn)物采用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行干燥，得到不同梯度的洗脫產(chǎn)物，其中60％乙醇洗脫得到的洗脫液濃縮干燥過后得到乙醇提取物52

8、1g。將乙醇提取物用雙蒸水充分溶解，然后用RP C18硅膠柱吸附，采用不同比例甲醇與水進(jìn)行洗脫，收集洗脫產(chǎn)物然后進(jìn)行濃縮冷凍干燥，在甲醇與水比例為50∶50的洗脫液到產(chǎn)物22.6g。將此產(chǎn)物用甲醇充分溶解，然后用制備型高效液相色譜儀進(jìn)行制備，獲得水溶性提取物A25.2mg。
　　脂溶性提取物B是白色不定形粉末。將江南卷柏全草去根曬干，采用中藥粉碎機(jī)徹底粉碎烘干，稱取15kg江南卷柏粉末樣品，采用100L95％乙醇進(jìn)行回流三次，每次

9、四小時，然后收集提取液，濃縮干燥過后稱重，得到江南卷柏乙醇粗提物1223g。將乙醇粗提物采用石油醚進(jìn)行脫脂，剩下的殘渣經(jīng)過晾干過后用乙酸乙酯進(jìn)行充分溶解，然后用大孔樹脂D101型吸附，采用乙酸乙酯進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，經(jīng)過濃縮干燥過后獲得乙酸乙酯提取物112.7g。將乙酸乙酯提取物上樣到RP C18硅膠柱上，采用不同濃度的石油醚/乙酸乙酯混合物進(jìn)行洗脫，分別收集各部分洗脫液，當(dāng)石油醚與乙酸乙酯比例為1∶6時，獲得的組分質(zhì)量為12.5g。

10、將其用乙酸乙酯充分溶解過后，上樣到Sephadex LH-20柱子上，通過不同濃度的甲醇進(jìn)行洗脫，分步收集洗脫液進(jìn)行濃縮干燥，在100％甲醇洗脫時候，獲得提取物質(zhì)量為2.2g，將此提取物用甲醇充分溶解，采用制備型高效液相色譜儀進(jìn)行制備，獲得脂溶性提取物B30.3mg。
　　對于江南卷柏水溶液提取物A和脂溶性提取物B，采用了一系列方法對這兩個化合物進(jìn)行了組成結(jié)構(gòu)的分析，結(jié)果如下。
　　江南卷柏水溶性提取物A分子量通過HPLC-

11、ESI-MS測定為m/z815.2252[M-H]，并根據(jù)核磁共振的結(jié)果，推測其分子式為C35H43O22。紅外光譜分析表明其具有芳香環(huán)，羥基與羰基，并且根據(jù)其在259nm和338nm處的紫外吸收峰，推測其具有黃酮醇骨架?；衔顰酸水解過后經(jīng)過HPLC測定，表明其具有D-葡萄糖殘基和D-半乳糖殘基，并且組成比例為2∶1，再根據(jù)1H NMR和13C NMR結(jié)果，推斷江南卷柏水溶性提取物A為黃酮苷類，其分子構(gòu)型如下:
　　7,3'-d

12、i-O-methylquercetin-4'-O-[β-galactosyl-(1→3)-β-glucoypranactosyl]-3-O-β-glucopyranoside
　　江南卷柏脂溶性提取物B通過HPLC-ESI-MS分析表明其分子量約為m/z251.0933[M-H]-，再結(jié)合核磁共振的結(jié)果以及不飽和度測試結(jié)果，推測其分子式為C13H16O5?；衔顱能夠與FeCl3-K3[Fe(CN]6]反應(yīng)，并且根據(jù)其在紅外吸收光

13、譜3344，3252 cm-1的吸收峰，表明其具有酚羥基結(jié)構(gòu)。其在232 and291nm的吸收峰以及在紅外吸收光譜(1735，1612，1427，1358，866 cm-1)的吸收峰表明其具有芳香環(huán)并具有不飽和酮基團(tuán)，再根據(jù)核磁共振氫譜與核磁共振碳譜的結(jié)果以及旋光度測試結(jié)果，推測江南卷柏脂溶性提取物B為異色滿衍生物，其構(gòu)型如下:
　　(3R)-5,6,7-trihydroxy-3-isopropyl-3-methylisochr

14、oman-1-one
　　江南卷柏提取物可以用于治療包括止血，吐血，便血，痔瘡出血，燒傷燙傷等，所以推測其具對傷口愈合可能具有促進(jìn)作用，所以通過體內(nèi)體外實驗對江南卷柏提取物對傷口的愈合作用進(jìn)行研究，體外實驗主要采用小鼠胚胎成纖維細(xì)胞NIH3T3作為研究模型，研究江南卷柏提取物A和B對NIH3T3的增殖，遷移等方面的作用，并分析其作用機(jī)制，體內(nèi)實驗主要采用SD大鼠切割傷傷口愈合模型測定純化產(chǎn)物對傷口愈合的作用關(guān)系。
　　通過體

15、外實驗研究發(fā)現(xiàn)，江南卷柏水溶性提取物A對小鼠胚胎成纖維細(xì)胞NIH3T3增殖，遷移的影響，并具有劑量依賴效應(yīng)，在低濃度的時候增殖和遷移的促進(jìn)效果(1uM)的時候，明顯低于在高濃度(10uM)的時候的增殖和遷移的促進(jìn)效果。另外與陽性對照硫酸皮膚素相比，江南卷柏水溶性提取物A的增殖和遷移的促進(jìn)效果與其接近，表明江南卷柏的水溶性提取物具有良好的促進(jìn)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞NIH3T3增殖和遷移效應(yīng)。
　　另外通過熒光定量PCR的結(jié)果表明，、江南

16、卷柏水溶液提取物A能夠促進(jìn)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞NIH3T3中CTGF基因mRNA的表達(dá)，其與江南卷柏水溶液提取物A的量成劑量相關(guān)，江南卷柏水溶液提取物A的濃度越高，其促進(jìn)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞NIH3T3的CTGF mRNA基因表達(dá)的量越高。與之相對應(yīng)的，江南卷柏水溶性提取物A能夠明顯的促進(jìn)CTGF蛋白的表達(dá)，其促進(jìn)效果與江南卷柏水溶性提取物A的濃度相關(guān)，濃度越高，促進(jìn)CTGF蛋白的表達(dá)的量越大。
　　通過SD大鼠切割傷傷口愈合模型研究

17、發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，江南卷柏水溶液提取物A能夠有效的促進(jìn)傷口收縮愈合，上皮生成，通過石蠟切片染色觀察，與空白對照組相比，江南卷柏水溶液提取物A處理過的傷口，成纖維細(xì)胞數(shù)量，血管數(shù)量以及膠原纖維的數(shù)量都明顯的增多。這些結(jié)果表明，江南卷柏水溶液提取物A能夠明顯的促進(jìn)SD大鼠切割傷傷口的愈合。
　　綜上所述，本課題從江南卷柏中提取物分離得到了兩個新的化合物，水溶性化合物A和脂溶性化合物B，并通過一系列分析方法測定出其化學(xué)組成和分子結(jié)

18、構(gòu)，A為黃酮苷類衍生物，B為異色滿類衍生物。同時對江南卷柏提取物A對皮膚傷口愈合的作用進(jìn)行了研究，體外實驗研究發(fā)現(xiàn)江南卷柏水溶液提取物A能夠明顯的促進(jìn)NIH3T3增殖和遷移，并通過熒光定量PCR和western blot測定表明，江南卷柏水溶液提取物A能夠增加NIH3T3結(jié)締組織生長因子(CTGF) mRNA與蛋白表達(dá)量，另外通過SD大鼠切割傷傷口愈合模型研究發(fā)現(xiàn)，江南卷柏水溶液提取物A能夠明顯的促進(jìn)皮膚傷口愈合。以上結(jié)果表明，江南卷柏