芥子氣脂肪蓄積新發(fā)現(xiàn)的生物學(xué)效應(yīng)研究.pdf

1、芥子氣(Sulfur Mustard，SM)是一種具有強(qiáng)烷基化能力的起皰劑，可快速透過(guò)皮膚、眼睛和肺支氣管粘膜等途徑進(jìn)入生物體內(nèi)與多種生命物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)。由于其制備簡(jiǎn)單、殺傷力大，在戰(zhàn)爭(zhēng)中被廣泛使用。當(dāng)前，日本二戰(zhàn)后遺棄在華的大量化學(xué)武器，其中以SM為主，仍在威脅中國(guó)人民的生命和財(cái)產(chǎn)安全。隨著近年來(lái)國(guó)際極端民族主義和宗教主義的死灰復(fù)燃，SM被用于恐怖襲擊和不對(duì)稱戰(zhàn)爭(zhēng)的可能性日益增大，因此繼續(xù)對(duì)SM損傷機(jī)理和防治手段的研究仍有重要的現(xiàn)實(shí)意義

2、。
　　自首次合成至今，對(duì)SM的毒理機(jī)制研究已持續(xù)了一個(gè)多世紀(jì)，科學(xué)家對(duì)SM損傷機(jī)制提出了很多假說(shuō)，但其明確機(jī)理仍然未知。由于芥子氣具有親脂性，暴露后會(huì)迅速透過(guò)機(jī)體表面屏障，侵入機(jī)體組織和循環(huán)系統(tǒng)，可與DNA、蛋白質(zhì)等絕大多數(shù)生物分子發(fā)生廣泛烷基化反應(yīng)。這些分子的烷基化會(huì)影響DNA的合成與修復(fù)，干擾酶活和細(xì)胞代謝，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、機(jī)體炎癥、免疫反應(yīng)和代謝紊亂的發(fā)生。同時(shí)SM損傷存在潛伏期，其癥狀在暴露數(shù)小時(shí)后才會(huì)出現(xiàn)，且癥狀反復(fù)

3、多樣，目前尚無(wú)SM損傷的特效治療方案。因此SM仍是一種難防難治的化學(xué)戰(zhàn)劑。
　　本課題組前期研究建立的SM原型的衍生化液-質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)方法，針對(duì)SM原型在大鼠組織中的分布進(jìn)行研究，結(jié)果提示脂肪組織中SM原型存在高水平持續(xù)留存，發(fā)現(xiàn)了SM脂肪蓄積的新現(xiàn)象并進(jìn)行了驗(yàn)證。同時(shí)通過(guò)SM-DNA加合物同時(shí)定量檢測(cè)方法的建立，本課題組對(duì)SM-DNA加合物在大鼠組織中的分布進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)脂肪含量高的組織中，如骨髓和腦，其SM-DNA加合物含量也

4、較高，且SM-DNA加合物在脂肪組織中可較長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)存在，提示親脂環(huán)境對(duì)加合物形成可能具有顯著影響。
　　基于實(shí)驗(yàn)室前期的研究結(jié)果，本論文通過(guò)體外染毒后脂肪細(xì)胞在DNA加合物形成、存活率和細(xì)胞損傷評(píng)價(jià)，以及大鼠染毒后脂肪組織脂體系數(shù)、病理?yè)p傷評(píng)價(jià)，對(duì)SM脂肪蓄積的毒性效應(yīng)進(jìn)行了研究;通過(guò)染毒后大鼠脂源因子mRNA水平和蛋白水平評(píng)價(jià)，初步探討了SM脂肪蓄積的生物學(xué)意義。全文共分為五章。
　　第一章是前言。該部分對(duì)SM在理化性質(zhì)

5、、歷史、損傷機(jī)制方面的研究進(jìn)展進(jìn)行了介紹，并對(duì)近年來(lái)脂肪組織功能和脂源因子研究的成果進(jìn)行了評(píng)述。提出了本論文的研究目的、研究?jī)?nèi)容和創(chuàng)新點(diǎn)。
　　第二章是體外染毒模型的建立。通過(guò)分離大鼠原代前脂肪細(xì)胞，對(duì)脂肪細(xì)胞分化條件進(jìn)行了優(yōu)化;通過(guò)培養(yǎng)人皮下前脂肪細(xì)胞（Human Preadipocytessubcultaneous，HPA-s），成功獲得高分化率(80％)的成熟脂肪細(xì)胞(HumanAdipocytes subcultaneou

6、s，HA-s);并成功培養(yǎng)傳代三種SM主要損傷組織的人源化細(xì)胞包括人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞(HaCaT)、人肺纖維細(xì)胞(HLF)、正常人類肝細(xì)胞(L-02)，作為對(duì)照細(xì)胞，為SM脂肪蓄積研究體外染毒實(shí)驗(yàn)提供細(xì)胞模型。同時(shí)通過(guò)CCK-8方法檢測(cè)包括成熟脂肪細(xì)胞在內(nèi)五種細(xì)胞的SM染毒IC50，結(jié)果顯示HA-s細(xì)胞的SM染毒IC50(484.3±22.7μM)遠(yuǎn)高于其它四種細(xì)胞(HaCaT77.5±5.5μM、HLF69.9±4.3μM、L-02

7、73.8±3.7μM、HPA-s62.5±0.4μM)，初步說(shuō)明脂肪細(xì)胞對(duì)SM染毒具有抵抗能力。
　　第三章是體外染毒SM-DNA加合物檢測(cè)?；谝呀⒌腢PLC-MS/MS方法，進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。結(jié)果表明該方法對(duì)從體外染毒細(xì)胞中提取SM-DNA加合物的檢測(cè)，具有較好的選擇性、檢測(cè)線性、準(zhǔn)確度、精密度和穩(wěn)定性，其定量限低(N7-HETEG為0.02 ng/mL、Bis-G為0.05 ng/mL、N3-HETEA為0.1 ng/mL

8、)，基質(zhì)效應(yīng)小，回收率高，樣品穩(wěn)定性也較好。各項(xiàng)參數(shù)均符合驗(yàn)證要求。確定其可被用于體外染毒細(xì)胞SM-DNA加合物的同時(shí)定量檢測(cè)。通過(guò)對(duì)包括成熟脂肪細(xì)胞在內(nèi)的五種細(xì)胞進(jìn)行體外染毒SM-DNA加合物的量時(shí)關(guān)系進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)包括成熟脂肪細(xì)胞在內(nèi)的不同染毒細(xì)胞SM-DNA加合物形成差異進(jìn)行了研究。結(jié)果表明SM-DNA單取代加合物形成速度高于雙取代加合物，而三種加合物的相對(duì)含量依次為:N7-HETEG＞Bis-G＞N3-HETEA;不同細(xì)胞SM-D

9、NA加合物形成的峰值差異較小，但成熟脂肪細(xì)胞雙取代加合物占比更高(＞33％)，在SM-DNA加合物達(dá)峰時(shí)間和清除速度上也低于其它組織來(lái)源細(xì)胞。從而在體外水平證實(shí)了SM脂肪蓄積現(xiàn)象和脂肪細(xì)胞對(duì)SM染毒的抵抗能力。
　　第四章是SM體外染毒對(duì)細(xì)胞功能的影響。通過(guò)高內(nèi)涵分析，從細(xì)胞核和細(xì)胞形態(tài)、溶酶體、線粒體、氧化應(yīng)激和DNA損傷方面對(duì)HPA-s和HA-s在SM染毒后細(xì)胞損傷與染毒劑量和染毒時(shí)間的變化趨勢(shì)進(jìn)行研究。結(jié)果顯示SM染毒造成了

10、細(xì)胞損傷，其程度與染毒劑量和染毒時(shí)間成依賴關(guān)系;染毒HA-s在溶酶體、線粒體、氧化應(yīng)激和DNA損傷方面細(xì)胞毒性指標(biāo)隨染毒劑量和時(shí)間變化的速度和水平均低于HPA-s。從細(xì)胞毒性參數(shù)角度揭示了成熟脂肪細(xì)胞對(duì)SM染毒損傷抵抗能力。同時(shí)選擇HA-s和HLF染毒上清與HaCaT、HLF和L-02染毒細(xì)胞共培養(yǎng)，通過(guò)CCK-8方法對(duì)染毒上清共培養(yǎng)細(xì)胞的活性進(jìn)行檢測(cè)，研究HA-s和HLF染毒上清對(duì)其它細(xì)胞活性的影響。結(jié)果表明HLF細(xì)胞染毒上清會(huì)提高其

11、它細(xì)胞體外染毒IC50值;而HA-s細(xì)胞染毒上清則會(huì)降低其它細(xì)胞體外染毒IC50值，同時(shí)降低程度與HA-s的染毒劑量成依賴關(guān)系。提示了脂源因子對(duì)其它細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用及脂肪蓄積SM的繼發(fā)毒性，以及清除脂肪細(xì)胞中的SM對(duì)降低機(jī)體繼發(fā)損傷的重要性。
　　第五章是SM染毒對(duì)大鼠脂肪組織功能的影響。通過(guò)大鼠染毒模型，獲得染毒大鼠體重和脂體系數(shù)變化趨勢(shì)數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示脂肪組織在機(jī)體染毒應(yīng)激反應(yīng)過(guò)程中被劇烈消耗，提示了脂肪中蓄積的SM隨組織劇烈

12、消耗而再次釋放的可能。
　　通過(guò)病理切片，評(píng)價(jià)了皮下、腎周、附睪和褐色脂肪組織的病理?yè)p傷情況。結(jié)果顯示脂肪組織暴露損傷主要體現(xiàn)為血管擴(kuò)張，和血管周圍炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，對(duì)成熟脂肪細(xì)胞的損傷則并不明顯。從體內(nèi)水平驗(yàn)證了成熟脂肪細(xì)胞對(duì)SM染毒的抵抗能力。
　　通過(guò)RT-qPCR和定量ELISA，對(duì)大鼠皮下脂肪組織中各脂源因子水平進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示SM染毒會(huì)導(dǎo)致促炎因子上調(diào)、抑炎因子下調(diào)，脂肪細(xì)胞分化因子和能量代謝因子的分泌也受到影響。