基于炎癥反應(yīng)的抗芥子氣損傷藥物研究.pdf

1、芥子氣(Sulfur Mustard，SM)是糜爛性毒劑的典型代表，接觸可引起皮膚、眼睛、呼吸道等組織器官的急性損傷并遺留長(zhǎng)期并發(fā)癥。皮膚接觸是芥子氣中毒的重要途徑，中毒早期病變包括紅斑、水皰、紫癜，隨著時(shí)間推移表現(xiàn)為色素沉著、皮膚干燥、瘙癢、脫屑和櫻桃狀血管瘤等，嚴(yán)重影響中毒者的生活質(zhì)量。芥子氣毒理機(jī)制復(fù)雜，目前尚無(wú)特效藥問(wèn)世。
　　芥子氣誘導(dǎo)的組織損傷與炎癥反應(yīng)關(guān)系密切。損傷區(qū)域聚集的大量中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞等可釋

2、放髓過(guò)氧化物酶、炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1、IL-8等，并誘導(dǎo)P物質(zhì)、組織蛋白酶、纖溶酶原激活物、組胺等釋放，導(dǎo)致組織紅腫、水皰、壞死等病理?yè)p傷。芥子氣誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)涉及多條信號(hào)通路，包括花生四烯酸代謝途徑、絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(Nuclear transcription factor-κB，NF-κB)信

3、號(hào)通路等?；ㄉ南┧峥山?jīng)環(huán)氧合酶和脂氧合酶催化產(chǎn)生前列腺素和白三烯。MAPK通路和NF-κB通路則可調(diào)節(jié)多種炎性介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄。以上述信號(hào)通路的關(guān)鍵信號(hào)分子為靶點(diǎn)的治療藥物研究一直是芥子氣損傷防治藥物研究的熱點(diǎn)和重要方向。
　　本研究針對(duì)芥子氣引起炎性損傷的不同環(huán)節(jié)，選擇了七大類抗炎和免疫抑制藥物，評(píng)價(jià)了它們對(duì)芥子氣所致皮膚損傷的保護(hù)作用，包括臨床常用的傳統(tǒng)抗炎藥甾體與非甾體抗炎藥，以及新型具有抗炎活性的藥物辣椒素受體激動(dòng)劑、p38抑

4、制劑、程序性壞死抑制劑、免疫抑制類藥物等，旨在明確不同種類抗炎藥物的抗芥子氣損傷活性及其藥效特點(diǎn)。在此基礎(chǔ)上，考察了以抗炎藥物為基礎(chǔ)的藥物聯(lián)用方案，為基于炎癥反應(yīng)的抗芥子氣損傷藥物研究提供了可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　目的：
　　考察不同類別抗炎/免疫抑制藥物及以抗炎藥物為基礎(chǔ)的藥物聯(lián)用方案對(duì)芥子氣所致皮膚損傷的保護(hù)作用。
　　方法：
　　芥子氣小鼠耳郭染毒模型的建立:采用32和128 mg/mL芥子氣5μL于雄性KM

5、小鼠右耳內(nèi)側(cè)皮膚染毒，染毒24 h、48 h后，采用直徑為8mm的打孔器取下耳郭標(biāo)本，立即稱重，計(jì)算腫脹率，將標(biāo)本置于4％甲醛溶液中固定，制備病理切片，觀察耳郭的組織病理學(xué)變化。
　　芥子氣全身中毒模型的建立:采用芥子氣40 mg/kg于雄性BalB/c小鼠皮下注射染毒建立芥子氣全身中毒致死模型，每天給予相應(yīng)藥物，觀察染毒7天內(nèi)動(dòng)物存活情況;芥子氣染毒細(xì)胞損傷模型的建立:將人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞系HaCaT細(xì)胞于200、1000μM芥

6、子氣染毒30 min后，PBS洗細(xì)胞一次，加入相應(yīng)藥物，繼續(xù)培養(yǎng)6、24 h，采用ATP法檢測(cè)細(xì)胞活力，采用ELISA試劑盒測(cè)定細(xì)胞上清中IL-6和IL-8的含量;p38抑制劑系列化合物細(xì)胞水平篩選模型:采用1μg/mL LPS刺激小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞，加入相應(yīng)藥物后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，采用AlphaLISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清中TNF-α含量，MTT法檢測(cè)活細(xì)胞數(shù);
　　芥子氣誘導(dǎo)p38和JNK激酶活化的時(shí)效關(guān)系考察:Ha

7、CaT細(xì)胞于200μM芥子氣染毒30 min后，PBS洗細(xì)胞一次，繼續(xù)培養(yǎng)0、0.5、1、1.5、3、6、12、24h，采用Luminex技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞裂解液中p-p38、t-p38、p-JNK和t-JNK的表達(dá);
　　p38抑制劑對(duì)芥子氣誘導(dǎo)p38和JNK激酶活化的影響:HaCaT細(xì)胞于200μM芥子氣染毒30 min后，PBS洗細(xì)胞一次，加入20μM SB203580或BIRB796繼續(xù)培養(yǎng)0.5、12h，采用Luninex技術(shù)

8、和Western Blotting檢測(cè)細(xì)胞裂解液中p-p38、t-p38、p-JNK和t-JNK的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　一、甾體與非甾體抗炎藥物抗染毒皮膚損傷作用評(píng)價(jià)
　　甾體和非甾體類抗炎藥是目前臨床使用最為廣泛的抗炎藥物，對(duì)多種病因所致的多種炎性疾病有良好的治療效果。甾體類抗炎藥通過(guò)調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄從而調(diào)節(jié)炎性介質(zhì)的產(chǎn)生，而非甾體類抗炎藥物主要通過(guò)抑制環(huán)氧合酶從而減少前列腺素的產(chǎn)生，降低機(jī)體炎癥反應(yīng)。本研究在建立

9、不同損傷程度的芥子氣耳郭皮膚染毒模型的基礎(chǔ)上，選擇甾體類抗炎藥物代表藥地塞米松和非甾體類抗炎藥代表藥吲哚美辛，考察了它們抗芥子氣損傷作用的藥效特點(diǎn)。
　　1.不同劑量芥子氣所致小鼠染毒耳郭皮膚損傷模型的建立
　　芥子氣所致皮膚損傷的嚴(yán)重程度與染毒劑量有關(guān)，染毒劑量越高，皮膚腫脹越明顯。本研究采用文獻(xiàn)中常用的32 mg/mL芥子氣5μL（低劑量）和在溶劑中達(dá)最大溶解度，即128 mg/mL，5μL（高劑量）兩個(gè)染毒劑量建立了不

10、同損傷程度的芥子氣小鼠耳郭染毒皮膚損傷模型，腫脹率分別為154.7％和204.8％。
　　2.甾體類抗炎藥地塞米松對(duì)芥子氣耳郭染毒小鼠皮膚損傷的影響
　　染毒前30 min灌胃給予甾體類抗炎藥物地塞米松（5 mg/kg）對(duì)芥子氣染毒小鼠耳郭腫脹無(wú)影響。
　　3.非甾體類抗炎藥吲哚美辛抗芥子氣損傷的藥效評(píng)價(jià)
　　染毒前30 min灌胃給予非甾體類抗炎藥吲哚美辛(10 mg/kg)對(duì)高、低劑量芥子氣染毒小鼠耳郭腫脹均

11、有顯著地抑制作用，腫脹抑制率分別是40.0％和25.7％。
　　新型具有抗炎活性藥物抗芥子氣損傷的藥效評(píng)價(jià)
　　芥子氣致傷機(jī)制復(fù)雜，涉及多種炎性反應(yīng)環(huán)節(jié)，因此我們還進(jìn)一步針對(duì)芥子氣致炎的其它環(huán)節(jié)開(kāi)展了研究。
　　1.辣椒素受體激動(dòng)劑抗芥子氣損傷作用評(píng)價(jià)
　　辣椒素受體激動(dòng)劑可通過(guò)耗竭P物質(zhì)抑制炎癥反應(yīng)，代表藥物為奧伐尼。臨床上用于減輕神經(jīng)性炎癥以及鎮(zhèn)痛止癢等。目前僅有少量文獻(xiàn)報(bào)道，其減輕芥子氣所致皮膚損傷，但作用

12、特點(diǎn)尚不明確。本研究以非甾體抗炎藥吲哚美辛為陽(yáng)性對(duì)照，考察了奧伐尼對(duì)染毒皮膚損傷的影響。結(jié)果表明，局部涂抹給予奧伐尼（0.125、0.25和0.05 mg/耳）對(duì)低劑量芥子氣染毒小鼠耳郭腫脹均有顯著地抑制作用，且強(qiáng)于吲哚美辛，腫脹抑制率分別是68.2％、87.0％和81.6％;奧伐尼對(duì)高劑量芥子氣染毒小鼠耳郭腫脹無(wú)明顯影響。進(jìn)一步采用伊紅-蘇木素染色，觀察奧伐尼對(duì)低劑量芥子氣染毒耳郭皮膚病理?yè)p傷的影響。結(jié)果表明，奧伐尼可顯著降低芥子氣誘

13、導(dǎo)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和表皮細(xì)胞壞死，且保護(hù)作用強(qiáng)于吲哚美辛。
　　2.p38抑制劑抗芥子氣損傷活性篩選與評(píng)價(jià)
　　p38激酶居于炎性反應(yīng)的中央環(huán)節(jié)，其抑制劑是近年來(lái)抗炎免疫藥理學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。BIRB796是第一個(gè)進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗(yàn)的p38抑制劑。本課題與化學(xué)合成實(shí)驗(yàn)室合作，獲得了50個(gè)BIRB796類似物，并對(duì)它們的抗芥子氣損傷活性進(jìn)行了篩選和評(píng)價(jià)。
　　2.1 BIRB796類似物的抗炎活性初篩
　　采用LPS誘導(dǎo)

14、小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞的體外模型，以p38抑制劑SB203580作為陽(yáng)性對(duì)照，觀察了50個(gè)化合物的抗炎活性。結(jié)果表明，化合物p38-98、p38-99、p38-123細(xì)胞毒性低，且可顯著性抑制LPS誘導(dǎo)TNF-α分泌，IC50分別為10.33μM、48.92μM和19.39μM。
　　2.1.1 p38抑制劑抗芥子氣損傷細(xì)胞水平藥效評(píng)價(jià)
　　2.1.1.1 p38抑制劑對(duì)芥子氣染毒HaCaT細(xì)胞活力的影響

15、　　采用芥子氣染毒HaCaT細(xì)胞模型，觀察了p38抑制劑SB203580、BIRB796以及活性化合物p38-98、p38-99對(duì)染毒細(xì)胞的保護(hù)作用。結(jié)果表明，SB203580、BIRB796、p38-98、p38-99在染毒后6h時(shí)可顯著改善200μM芥子氣所致細(xì)胞活力的降低。
　　2.1.1.2 p38抑制劑對(duì)芥子氣染毒HaCaT細(xì)胞IL-6和IL-8分泌的影響
　　采用芥子氣染毒HaCaT細(xì)胞模型，觀察了p38抑制劑S

16、B203580、BIRB796以及活性化合物p38-98、p38-99對(duì)染毒細(xì)胞炎性介質(zhì)分泌的影響。結(jié)果表明，SB203580、BIRB796、p38-98、p38-99均可顯著地抑制炎性細(xì)胞因子IL-6和趨化因子IL-8的分泌，并呈良好的劑量依賴關(guān)系。在兩種p38抑制劑代表化合物中，BIRB796抑制作用強(qiáng)于SB203580。
　　2.1.2 p38抑制劑抗芥子氣損傷整體動(dòng)物水平藥效評(píng)價(jià)
　　2.1.2.1 p38抑制劑對(duì)

17、芥子氣耳郭染毒小鼠皮膚損傷的影響
　　染毒前24 h、30 min以及染毒后12 h腹腔注射給予SB203580、BIRB796以及活性化合物p38-98、p38-99(10mg/kg)，考察了上述p38抑制劑對(duì)染毒皮膚損傷的影響。結(jié)果表明，除SB203580外，BIRB796、p38-98、p38-99對(duì)耳腫脹均有一定的抑制趨勢(shì)，抑制率分別是20.5％、17.4％和17.8％。
　　2.1.2.2 p38抑制劑對(duì)芥子氣全身

18、中毒小鼠存活的影響
　　采用芥子氣40 mg/kg(LD99)進(jìn)行皮下注射染毒建立芥子氣全身中毒模型，靜脈注射給予p38抑制劑SB203580、BIRB796以及活性化合物p38-98、p38-99(5 mg/kg/d)，觀察小鼠染毒7天內(nèi)的死亡情況。結(jié)果表明，模型組小鼠于染毒第5天全部死亡，藥物處理組小鼠分別于染毒第6天和第7天全部死亡，提示p38抑制劑對(duì)全身中毒小鼠的存活率無(wú)明顯影響
　　2.1.2.3 p38抑制劑中活

19、性化合物代謝穩(wěn)定性研究
　　采用大鼠肝微粒體模型，對(duì)SB203580、BIRB796、p38-98、p38-99進(jìn)行初步的代謝穩(wěn)定性分析。結(jié)果表明，p38-98在大鼠肝微粒體中孵育60 min后原型剩余量達(dá)到50％。提示p38-98具有較好的代謝穩(wěn)定性。
　　2.1.3 SB203580和BIRB796抗芥子氣損傷機(jī)制研究
　　從藥效評(píng)價(jià)結(jié)果可知，變構(gòu)型p38抑制劑BIRB796對(duì)芥子氣炎性損傷的保護(hù)作用強(qiáng)于競(jìng)爭(zhēng)性p3

20、8抑制劑SB203580。本研究從對(duì)應(yīng)激活化蛋白激酶(stress-activated proteinkinases，SAPKs)c-Jun氨基末端激酶(c-Jun Nterminal kinase，JNK)與p38活性的影響的角度，對(duì)SB203580和BIRB796的抗炎機(jī)制進(jìn)行了考察。
　　2.1.4芥子氣誘導(dǎo)染毒HaCaT細(xì)胞p38和JNK激酶活化
　　首先采用Luminex液相芯片技術(shù)，考察了芥子氣對(duì)HaCaT細(xì)胞p

21、38與JNK磷酸化的影響。結(jié)果表明，芥子氣可迅速誘導(dǎo)p38和JNK激酶磷酸化水平升高，并在染毒后0.5 h達(dá)到高峰。
　　2.1.5 p38抑制劑對(duì)SM誘導(dǎo)p38和JNK激酶活化的影響
　　進(jìn)而采用Luminex液相芯片技術(shù)和Western Blotting，檢測(cè)SB203580和BIRB796對(duì)染毒HaCaT細(xì)胞p38和JNK激酶磷酸化的影響。結(jié)果表明，BIRB796可同時(shí)抑制芥子氣誘導(dǎo)的p38和JNK激酶的磷酸化，而SB

22、203580抑制p38激酶的磷酸化，卻引起JNK激酶磷酸化程度升高。
　　綜上可知，p38抑制劑對(duì)染毒細(xì)胞模型有顯著的保護(hù)作用，對(duì)染毒皮膚損傷有一定保護(hù)趨勢(shì)。相比SB203580，BIIRB796保護(hù)作用更明顯，這可能與BIRB796同時(shí)抑制芥子氣誘導(dǎo)的p38和JNK磷酸化，而SB203580抑制p38卻代償性引起JNK磷酸化升高有關(guān)。
　　3.程序性壞死抑制劑抗芥子氣損傷作用評(píng)價(jià)
　　程序性壞死是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種由死

23、亡受體介導(dǎo)的caspases非依賴性細(xì)胞死亡模式，在凋亡被抑制的情況仍可介導(dǎo)細(xì)胞壞死，其在炎癥性病變、缺血性心腦血管病、神經(jīng)退行性疾病等多種疾病的發(fā)生發(fā)展及腫瘤細(xì)胞的耐藥方面具有重要意義。DNA烷基化損傷可誘導(dǎo)細(xì)胞程序性壞死。而關(guān)于程序性壞死是否參與了芥子氣誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷目前尚無(wú)報(bào)道。本研究首次進(jìn)行了程序性壞死抑制劑抗芥子氣損傷作用的研究。
　　3.1程序性壞死抑制劑對(duì)染毒HaCaT細(xì)胞存活的影響
　　采用芥子氣染毒HaCa

24、T細(xì)胞模型，同時(shí)加入凋亡抑制劑z-VAD-fmk阻斷細(xì)胞凋亡，觀察程序性壞死抑制劑Nec-1對(duì)細(xì)胞存活的影響。結(jié)果表明，Nec-1、z-VAD-fmk單用時(shí)對(duì)芥子氣所致HaCat細(xì)胞死亡具有明顯保護(hù)作用，兩者合用時(shí)對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用明顯增強(qiáng)，細(xì)胞存活率接近100％。提示，程序性壞死參與芥子氣誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。
　　3.2程序性壞死抑制劑對(duì)芥子氣染毒小鼠耳郭腫脹的影響
　　進(jìn)一步，對(duì)程序性壞死抑制劑抗芥子氣所致皮膚損傷的作用進(jìn)行評(píng)價(jià)

25、。結(jié)果表明，染毒前腹腔注射給予Nec-1(4 mg/kg)和z-VAD-fmk(10 mg/kg)對(duì)染毒耳腫脹均無(wú)明顯影響。
　　4.免疫抑制劑抗芥子氣損傷的藥效評(píng)價(jià)
　　FTY720可通過(guò)降低外周血淋巴細(xì)胞數(shù)從而降低機(jī)體免疫反應(yīng)，目前其治療腎移植排斥反應(yīng)已進(jìn)入Ⅲ期臨床研究階段，對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型的改善作用也已取得初步療效。本研究采用小鼠芥子氣耳郭皮膚染毒模型，考察了S1P抑制劑FTY720對(duì)芥子氣染毒小鼠皮膚損傷的影響。

26、結(jié)果表明，提前3天按1 mg/kg/d連續(xù)灌胃給予FTY720對(duì)芥子氣染毒小鼠耳郭腫脹無(wú)明顯影響。
　　5.中藥制劑抗芥子氣損傷的藥效評(píng)價(jià)
　　七葉皂苷鈉具有抗炎抗?jié)B出的作用，并可促進(jìn)體內(nèi)皮質(zhì)醇類化合物的分泌。結(jié)果表明，七葉皂苷鈉凝膠涂抹給藥及腹腔注射給藥（5 mg/kg）對(duì)芥子氣染毒小鼠耳郭腫脹均無(wú)明顯影響。
　　三、抗炎藥物與其他藥物合用抗芥子氣損傷的藥效評(píng)價(jià)
　　芥子氣損傷機(jī)制復(fù)雜，單一藥物的療效有限，因此

27、，為提高治療效果，需要針對(duì)不同的損傷機(jī)制采用聯(lián)合用藥和綜合性治療措施。聚(ADP-核糖)聚合酶(Poly(ADP-ribose)polymerase，PARP)是目前外軍認(rèn)為最有前景的抗芥子氣損傷的治療靶點(diǎn)。本課題進(jìn)一步考察了抗炎藥物與PARP抑制劑合用對(duì)抗芥子氣損傷的保護(hù)作用。
　　1.吲哚美辛與PRAP抑制劑合用對(duì)小鼠耳郭染毒模型的影響
　　染毒前給予非甾體抗炎藥吲哚美辛（10mg/kg，po）和PARP抑制劑MUS00

28、3(200mg/kg，ip)，考察兩者合用對(duì)芥子氣染毒皮膚損傷的影響。結(jié)果表明，低劑量芥子氣染毒條件下，吲哚美辛組與兩藥合同組均可降低耳腫脹程度，抑制率分別為45.0％和19.1％。高劑量芥子氣染毒條件下，MUS003、吲哚美辛及藥物合用組均可降低耳腫脹程度，抑制率依次是21.8％、28.9％和32.4％。
　　2.奧伐尼與PRAP抑制劑合用對(duì)小鼠耳郭染毒模型的影響
　　染毒前給予辣椒素受體激動(dòng)劑奧伐尼（0.5 mg/耳，涂

29、抹）與PARP抑制劑MUS003（200 mg/kg，ip），考察兩者合用對(duì)芥子氣染毒皮膚損傷的影響。結(jié)果表明，低劑量芥子氣染毒條件下，奧伐尼組與藥物合同組均可降低耳腫脹程度，抑制率分別為56.9％和72.2％，且兩藥抑制耳腫脹具有顯著地交互作用。在高劑量芥子氣染毒條件下，MUS003組與合用組均可降低耳腫脹程度，抑制率為6.5％和28.3％。
　　結(jié)論：
　　1.非甾體抗炎藥吲哚美辛對(duì)低(32 mg/mL)、高（128mg

30、/mL）染毒劑量所致皮膚損傷具有較好的保護(hù)作用。辣椒素受體激動(dòng)劑奧伐尼對(duì)低劑量芥子氣所致皮膚損傷保護(hù)作用明顯，優(yōu)于吲哚美辛;
　　2.非競(jìng)爭(zhēng)性（變構(gòu)型）p38抑制劑BIRB796對(duì)芥子氣損傷的保護(hù)作用強(qiáng)于競(jìng)爭(zhēng)性p38抑制劑SB203580，這可能與BIRB796同時(shí)抑制SM誘導(dǎo)的p38和JNK磷酸化，而SB203580抑制p38激酶同時(shí)代償性地引起JNK激酶磷酸化程度升高有關(guān);
　　3.首次發(fā)現(xiàn)程序性壞死抑制劑可保護(hù)芥子氣誘

31、導(dǎo)的表皮細(xì)胞死亡，提示這一壞死機(jī)制參與了芥子氣誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡;
　　4.基于抗炎藥物的藥物組合方案中，奧伐尼與PARP抑制劑MUS003合用對(duì)芥子氣染毒小鼠皮膚損傷保護(hù)作用優(yōu)于單用方案，可作為備選藥物組合方案進(jìn)行下一步研究。
　　綜上，本研究通過(guò)對(duì)基于炎癥反應(yīng)不同環(huán)節(jié)的多種類別的抗炎藥物進(jìn)行了抗芥子氣損傷的藥效評(píng)價(jià)，明確了各類藥物對(duì)芥子氣損傷的保護(hù)作用及其特點(diǎn)，并提出了基于抗炎藥物的抗芥子氣損傷組合用藥方案，為基于炎性反應(yīng)的