高通量抗IAV藥物篩選模型的構(gòu)建及檳榔堿抗IAV誘導(dǎo)的炎癥損傷藥效藥理學(xué)研究.pdf

1、甲型流感病毒（IAV）作為全球嚴(yán)重的傳染病之一，一直威脅著人類健康，20世紀(jì)以來的多次大流行已造成數(shù)千萬人死亡，多數(shù)患者死于IAV誘導(dǎo)的急性肺損傷（ALI）或急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）。Nox2 NADPH氧化酶是IAV誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞產(chǎn)生過量活性氧（ROS）造成肺損傷的重要因素，Nrf2/ARE信號(hào)通路是細(xì)胞氧化應(yīng)激的關(guān)鍵通路。本文基于Nox2 NADPH氧化酶和抗氧化反應(yīng)元件（ARE）構(gòu)建高通量藥物篩選模型，用于抗IAV藥物的篩選

2、，并對(duì)篩選出的藥物進(jìn)行藥效藥理機(jī)制研究。
　　基于p47phox與p22phox兩亞基相互作用是Nox2 NADPH氧化酶活化的關(guān)鍵，本文構(gòu)建了Nox2雙分子熒光互補(bǔ)相關(guān)質(zhì)粒（SH3/p47phox-pMC、p22phox-pMN）；同時(shí)，利用p47phox、p67phox及 ARE啟動(dòng)子序列構(gòu)建了NCF1、NCF2、ARE啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，建立多種細(xì)胞水平的藥物篩選平臺(tái)。在上述模型中，ARE-luc比較成熟，可用于后續(xù)

3、藥物篩選工作。
　　用ARE-luc模型對(duì)134種中藥粗提物進(jìn)行初步篩選，發(fā)現(xiàn)青蒿、當(dāng)歸、葛根、白花蛇舌草、檳榔堿均能顯著促進(jìn)ARE轉(zhuǎn)錄，其中檳榔堿活性為空白對(duì)照的4.72倍。體外實(shí)驗(yàn)，利用空斑試驗(yàn)檢測檳榔粗提物（ANE）及檳榔堿的抗IAV活性；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，滴鼻感染6周齡Balb/c小鼠建立小鼠肺炎模型，進(jìn)行檳榔堿藥效藥理分析，包括：感染第4天小鼠肺組織病毒滴度、炎癥因子、超氧化物水平、病理損傷程度及相應(yīng)通道蛋白水平的檢測，及持續(xù)2

4、周的體重變化和生存率分析。
　　體外抗IAV試驗(yàn)顯示，ANE可顯著抑制PR8增殖，但檳榔堿對(duì)PR8復(fù)制無明顯抑制作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，檳榔堿能一定程度減輕肺組織水腫程度，改善病理損傷，極顯著（P<0.01）促進(jìn)IL-10轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)HO-1表達(dá)，減緩感染小鼠的體重下降，提高生存率。但檳榔堿對(duì)TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA的變化及JNK1、Akt、p38MAPK、Erk1/2的磷酸化水平無顯著影響（P>0.05）。
　　由于

5、毒性作用，檳榔被WHO列為一級(jí)致癌物，為此我們研究了ANE的致口腔黏膜成纖維細(xì)胞纖維化效應(yīng)及人工牛黃（CB）對(duì)它的拮抗效應(yīng)。體外實(shí)驗(yàn)，用ANE誘導(dǎo)口腔黏膜成纖維細(xì)胞異常增長模型，進(jìn)行CB的藥效學(xué)研究。結(jié)果顯示，CB可明顯抗ANE的細(xì)胞毒作用。
　　總之，我們成功建立了ARE-luc藥物篩選模型，并發(fā)現(xiàn)ANE良好的抗IAV潛能，檳榔堿在抗IAV誘導(dǎo)的ALI方面也體現(xiàn)出一定的效果。另，CB能有效拮抗ANE的毒副作用，為檳榔堿的進(jìn)一步開