鱗翅目昆蟲新發(fā)現(xiàn)的Treh1B基因的初步研究.pdf

1、昆蟲海藻糖酶在昆蟲生長發(fā)育，飛行能量供給，幾丁質合成的調節(jié)以及機體抗逆性等方面具有重要的作用。Treh1B基因是從全基因組水平對家蠶、紅帶袖蝶、君主斑蝶等多個鱗翅目昆蟲的海藻糖酶基因進行分析新發(fā)現(xiàn)的海藻糖酶基因。以鱗翅目昆蟲模式生物家蠶為研究對象，通過進化分析和共線性分析發(fā)現(xiàn)，它是通過Treh1A基因復制產生，這兩個基因序列相似，結構相似，相鄰串聯(lián)在家蠶17號染色體上。兩個基因分別編碼一條578個和579個氨基酸多肽，兩條多肽有49％的

2、相似度。
　　本課題主要包括以下5部分的研究:
　　1、首先通過序列分析對鱗翅目昆蟲海藻糖酶的進化和功能分歧進行了分析，結果顯示Treh1基因只有在鱗翅目昆蟲中發(fā)生了復制，產生了Treh1B基因，而且復制基因發(fā)生功能分歧，有趣的是鱗翅目昆蟲中還存在兩種不同的Treh1B。
　　2、以鱗翅目昆蟲模式生物家蠶為研究對象研究Treh1B，即BmTreh1B，首先研究了它的mRNA和蛋白質表達譜，結果顯示在幼蟲期表達量低，在蛹

3、期和成蟲期表達量高，而且在成蟲中的前后翅，腿和觸角中表達量相對較高。
　　3、在BmN家蠶卵巢細胞中分別對BmTreh1A，BmTreh1B和BmTreh2進行亞細胞定位，結果顯示，BmTreh1A定位在細胞質中;BmTreh2定位在核膜和細胞器膜上;而BmTreh1B定位在細胞器中，推測是溶酶體中。
　　4、用桿狀病毒表達系統(tǒng)表達并用鎳柱純化了BmTreh1A，BmTreh1B，BmTreh2，TvTreh1B和short

4、 BmTreh1B重組蛋白，然后用純化的重組蛋白分別測定了它們的酶動力學性質，如底物特異性，最適pH，抑制劑，Km和Vmax值。結果顯示，BmTreh1A，BmTreh1B，BmTreh2特異性水解海藻糖，最適pH均為酸性，但BmTreh1B的耐酸性更強，最適pH為5，BmTreh1A和BmTreh2最適pH為6，井岡霉素對三個海藻糖酶的抑制效果顯著，而α-葡萄糖苷抑制劑的抑制效果不顯著;與BmTreh1A和BmTreh2相比，BmTr

5、eh1B的Km值較大。而TvTreh1B和相應截短的BmTreh1B卻沒有酶活性。
　　5、用CRIPRS/Cas9技術獲得了三種純合Bm Treh1B突變體基因型，并進行了表型的初步分析，結果發(fā)現(xiàn)BmTreh1B基因的缺失導致了家蠶各個時期個體偏小和成蟲翅膀的畸形，說明BmTreh1B可能調控翅膀的發(fā)育。
　　綜上所述，在鱗翅目昆蟲中新發(fā)現(xiàn)了一個海藻糖酶Treh1B基因，本課題研究Bm Treh1B基因發(fā)現(xiàn)它在時空表達和亞