鱗翅目昆蟲新發(fā)現(xiàn)的Treh1B基因的初步研究.pdf

1、昆蟲海藻糖酶在昆蟲生長發(fā)育，飛行能量供給，幾丁質(zhì)合成的調(diào)節(jié)以及機(jī)體抗逆性等方面具有重要的作用。Treh1B基因是從全基因組水平對家蠶、紅帶袖蝶、君主斑蝶等多個鱗翅目昆蟲的海藻糖酶基因進(jìn)行分析新發(fā)現(xiàn)的海藻糖酶基因。以鱗翅目昆蟲模式生物家蠶為研究對象，通過進(jìn)化分析和共線性分析發(fā)現(xiàn)，它是通過Treh1A基因復(fù)制產(chǎn)生，這兩個基因序列相似，結(jié)構(gòu)相似，相鄰串聯(lián)在家蠶17號染色體上。兩個基因分別編碼一條578個和579個氨基酸多肽，兩條多肽有49％的

2、相似度。
　　本課題主要包括以下5部分的研究:
　　1、首先通過序列分析對鱗翅目昆蟲海藻糖酶的進(jìn)化和功能分歧進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示Treh1基因只有在鱗翅目昆蟲中發(fā)生了復(fù)制，產(chǎn)生了Treh1B基因，而且復(fù)制基因發(fā)生功能分歧，有趣的是鱗翅目昆蟲中還存在兩種不同的Treh1B。
　　2、以鱗翅目昆蟲模式生物家蠶為研究對象研究Treh1B，即BmTreh1B，首先研究了它的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)譜，結(jié)果顯示在幼蟲期表達(dá)量低，在蛹

3、期和成蟲期表達(dá)量高，而且在成蟲中的前后翅，腿和觸角中表達(dá)量相對較高。
　　3、在BmN家蠶卵巢細(xì)胞中分別對BmTreh1A，BmTreh1B和BmTreh2進(jìn)行亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示，BmTreh1A定位在細(xì)胞質(zhì)中;BmTreh2定位在核膜和細(xì)胞器膜上;而BmTreh1B定位在細(xì)胞器中，推測是溶酶體中。
　　4、用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)并用鎳柱純化了BmTreh1A，BmTreh1B，BmTreh2，TvTreh1B和short

4、 BmTreh1B重組蛋白，然后用純化的重組蛋白分別測定了它們的酶動力學(xué)性質(zhì)，如底物特異性，最適pH，抑制劑，Km和Vmax值。結(jié)果顯示，BmTreh1A，BmTreh1B，BmTreh2特異性水解海藻糖，最適pH均為酸性，但BmTreh1B的耐酸性更強(qiáng)，最適pH為5，BmTreh1A和BmTreh2最適pH為6，井岡霉素對三個海藻糖酶的抑制效果顯著，而α-葡萄糖苷抑制劑的抑制效果不顯著;與BmTreh1A和BmTreh2相比，BmTr

5、eh1B的Km值較大。而TvTreh1B和相應(yīng)截短的BmTreh1B卻沒有酶活性。
　　5、用CRIPRS/Cas9技術(shù)獲得了三種純合Bm Treh1B突變體基因型，并進(jìn)行了表型的初步分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BmTreh1B基因的缺失導(dǎo)致了家蠶各個時期個體偏小和成蟲翅膀的畸形，說明BmTreh1B可能調(diào)控翅膀的發(fā)育。
　　綜上所述，在鱗翅目昆蟲中新發(fā)現(xiàn)了一個海藻糖酶Treh1B基因，本課題研究Bm Treh1B基因發(fā)現(xiàn)它在時空表達(dá)和亞