大鼠Hrh1基因新發(fā)現(xiàn)的cSNP位點(diǎn)及相關(guān)研究.pdf

1、組胺是組胺酸在組胺酸脫羧酶(HDC)作用下形成的體內(nèi)作用最廣泛的單胺類物質(zhì)之一，是I型超敏反應(yīng)中的主要效應(yīng)分子，組胺通過與其相結(jié)合的Hrh1(H1)參與機(jī)體內(nèi)多種生理功能的調(diào)節(jié)。Hrh1是研究神經(jīng)—內(nèi)分泌—免疫—效應(yīng)器軸的重要中介。Hrh1作為單拷貝基因，在大鼠基因組中定位于4號(hào)染色體，4q42區(qū)。直至最近的研究才發(fā)現(xiàn)，人類的Hrh1基因?qū)儆跓o內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)基因。截至2009年4月，NCBI中報(bào)道的人類基因組無內(nèi)含子基因約為180個(gè)，數(shù)量

2、遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于有內(nèi)含子基因，但是，真核生物的無內(nèi)含子基因在比較物種進(jìn)化與基因組的遺傳變異中起著重要的作用，近年來已逐漸引起人們的興趣。大鼠Hrh1基因也是無內(nèi)含基因，全長均為外顯子。本研究選擇大鼠Hrh1基因研究其基因組與轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA的堿基突變，核苷酸多態(tài)性，為今后研究人類基因組Hrh1基因多態(tài)性，相關(guān)突變及與Hrh1表達(dá)產(chǎn)物(組胺H1受體)的遺傳藥理學(xué)與藥物基因組奠定前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本研究四個(gè)部分： 第一部分實(shí)驗(yàn)，研究了大鼠Hr

3、h1基因在大鼠全血基因組、大鼠腦組織轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA以及大鼠肝組織轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA中序列的堿基差異。主要實(shí)驗(yàn)操作方法為：從雄性SD大鼠中用碘化鉀法提取全血基因組DNA，Trizole法提取大鼠腦組織與肝組織的總RNA。紫外分光光度法與瓊脂糖凝膠電泳鑒定提取的核酸純度與濃度合格后，以腦組織和肝組織的總RNA為模板，RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kits逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。根據(jù)NCBI

4、公布的大鼠Hrh1基因組DNA(gi:62750804)及mRNA序列(gi:220770)，應(yīng)用Vector NTI Suite10.0軟件，針對Hrh1的蛋白編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)克隆編碼區(qū)全長的引物，為便于今后研究Hrh1基因的表達(dá)，在上下游引物的5’引入不同的限制性酶酶切位點(diǎn)。使用保真度極高的PrimeSTARTM HS DNA Polymerase，以所提取的大鼠全血基因組DNA、腦組織cDNA以及肝組織cDNA為模板，使用聚合酶鏈反

5、應(yīng)(PCR)方法克隆大鼠Hrh1編碼區(qū)全長。PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒對PCR反應(yīng)的產(chǎn)物進(jìn)行純化。用限制性內(nèi)切酶雙酶切法對基因組DNA、腦cDNA、肝cDNA PCR純化產(chǎn)物與克隆載體pUC19進(jìn)行雙酶切。小量膠回收試劑盒進(jìn)行酶切產(chǎn)物的純化回收。T4 DNA Ligase分別將基因DNA，腦cDNA，肝cDNA酶切產(chǎn)物與pUC19載體進(jìn)行粘性末端的連接，構(gòu)建pUC19-Hrh1重組載體。 第二部分實(shí)驗(yàn)中，主要研究不同抗凝劑對全血

6、基因組DNA提取的純度和得率，尤其是下游的基因擴(kuò)增的影響。在第一部分實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用肝素鈉抗凝時(shí)，紫外分光光度法與瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA得率與純度都令人滿意，但PCR擴(kuò)增時(shí)，結(jié)果并不穩(wěn)定，效果亦不理想。在排除多種因素并查閱了相關(guān)資料后，推測有可能是抗凝血中抗凝劑的使用對基因組DNA的擴(kuò)增效率產(chǎn)生影響?？紤]到EDTA對PCR反應(yīng)的催化劑Mg2+的螯合作用，我們沒有選擇EDTA作為抗凝劑，而是選用枸櫞酸鈉與肝素作為抗凝劑，分別

7、對大鼠動(dòng)脈血與靜脈血抗凝后，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)比較。 第三部分實(shí)驗(yàn)選擇健康雄性SPF SD級(jí)大鼠7只，健康雌性SD大鼠6只，頸靜脈取血，碘化鉀法提取全血基因組DNA。紫外分光光法與瓊脂糖電泳鑒定DNA的濃度與純度。PrimeSTARTM HS DNAPolymerase高保真擴(kuò)增大鼠Hrh1編碼區(qū)全長，瓊脂糖電泳鑒定PCR產(chǎn)物，小量膠回收試劑盒進(jìn)行剩余PCR產(chǎn)物的純化回收。純化產(chǎn)物送北京諾賽基因組研究中心有限公司進(jìn)行測序。通過分析13只

8、大鼠的基因組Hrh1序列測序峰圖，我們發(fā)現(xiàn)在大鼠Hrh1CDS全長1461 bp中，共有4個(gè)cSNP位點(diǎn)，分別為：237位C/T多態(tài)；928位A/G多態(tài)；1041位C/T多態(tài)；1342位G/A多態(tài)。并對13例樣本4個(gè)cSNP位點(diǎn)用SPSS15.0進(jìn)行了頻率統(tǒng)計(jì)。 第四部分實(shí)驗(yàn)中，探索了等位基因特異性擴(kuò)增法(alleles specific amplification，ASA)檢測928與1342位cSNP。選擇第三部分實(shí)驗(yàn)中通

9、過測序確定序列的1號(hào)(928 A/G1342 G/A)、2號(hào)(928G/G,1342A/A)、8號(hào)(928A/A,1342 G/G)大鼠做為測定樣本。ASA PCR引物的設(shè)計(jì)至關(guān)重要。針對928位(A/G)和1342位(G/A)cSNP位點(diǎn)，應(yīng)用Vector NTI Suite10.0軟件設(shè)計(jì)引物。2個(gè)位點(diǎn)的引物都是在下游引物3’端設(shè)計(jì)相應(yīng)的堿基探針，與探針相鄰的堿基設(shè)計(jì)成錯(cuò)配。提取全血基因組DNA，高保真擴(kuò)增Hrh1全長，PCR產(chǎn)物純