肝病患者真菌的感染特點和質譜快速鑒定研究.pdf

1、目的:
　　真菌是廣泛分布于自然界的真核生物，已被發(fā)現的約10萬種，其中對人類具有致病性約300種，不同種真菌的生長特性、臨床特點及耐藥性不同。由于抗菌藥物和免疫抑制劑的廣泛應用、放化療治療的增加、器官移植及介入技術操作的開展，導致機體免疫功能低下人群增加，使很多機會致病真菌引起感染，成為免疫功能低下患者的重要死亡原因。另外，肝病患者由于蛋白低、單核巨噬細胞系統(tǒng)受損、白細胞粘附趨化和吞噬能力降低、腸道內菌群失調等原因成為易感染真菌

2、感染的易感人群，真菌感染的發(fā)病率和病死率呈逐年上升趨勢，引起臨床的高度關注。同時，隨著抗真菌藥物的大量應用，真菌的耐藥性也日益突出，為臨床的經驗用藥提出了挑戰(zhàn)。快速明確感染真菌的特點及耐藥狀況，成為臨床救治的關鍵。
　　真菌的特點是生長緩慢，傳統(tǒng)的培養(yǎng)鑒定方法所需時間較長，一般3-7天，且日益多樣化的真菌，使鑒定難度不斷增加均限制了臨床的早期診斷和針對性治療?；|輔助激光解吸電離飛行時間質譜（Matrix-AssistedLase

3、r-Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF MS）是近年快速發(fā)展起來的一種新興的診斷技術，可以通過直接檢測生物標志物（蛋白）來鑒定細菌、分枝桿菌、病毒等，具有快速、準確、簡便、成本低的特點。但它對真菌的鑒定評價說法不一，主要原因真菌的細胞壁厚，前處理方法不成熟導致鑒定結果的差異。
　　為此本研究通過把質譜儀鑒定真菌的結果與生化鑒定、分子生物學

4、等技術鑒定結果比對，探索質譜技術快速鑒定真菌的方法，評價其真菌鑒定能力，為臨床快速診斷真菌感染提供可靠的依據;同時對我院肝病患者真菌感染的臨床資料和藥敏情況進行統(tǒng)計分析，找到肝病患者真菌感染的病原組成特點及增長趨勢，分析其對不同種類抗真菌藥物的耐藥性，更好的指導臨床合理的應用抗真菌藥物治療，達到有效控制真菌感染的目的。
　　方法:
　　收集我院2011年-2014年分離自臨床肝病住院患者的2236株真菌的臨床資料（7天內分離

5、自同一患者相同部位的真菌不重復統(tǒng)計），對其易感人群、感染部位及菌群分布等特點進行統(tǒng)計分析。用氟康唑、兩性霉素B、伊曲康唑、伏立康唑對2236株真菌進行K-B法藥敏試驗，統(tǒng)計分析其耐藥性。用布魯克公司的Microflex型質譜儀對其中327株真菌菌株進行快速鑒定，結果與VITEK-2（酵母樣真菌）和顯微鏡檢查（絲狀真菌）的鑒定結果比對，有差異的用分子生物學方法確認鑒定。
　　結果:
　　從我院近四年肝病患者標本分離真菌的情況分

6、析，真菌感染多發(fā)于男性患者，男女比例為1.73∶1，平均年齡為54±14.79歲。肝病患者真菌感染更易發(fā)生在肝硬化失代償期、肝癌及重癥肝炎患者，其中肝硬化失代償期的患者所占比例為69.65％，肝癌患者占16.97％。真菌的分離數量從2011年的61株，急劇增長到2014年的1222株，增長了19.03倍。四年共分離真菌2236株，酵母樣真菌1889株，占84.48％，絲狀真菌347株，占15.52％;酵母樣真菌的年分離率占絕對優(yōu)勢，20

7、11年為63.93％，2012年為85.42％，2013年為84.92％，2014年為85.02％。真菌分離的種類也由2011年的15種增加到了目前的近30種。在眾多真菌種類中，居首的為白假絲酵母菌(52.64％)，其次為熱帶假絲酵母菌(13.86％)和煙曲霉菌(12.03％)。真菌感染部位多發(fā)于呼吸道，占66.41％，其中酵母樣真菌占52.24％，絲狀真菌占14.18％;呼吸道分離的真菌種類以白假絲酵母菌為主，占35.15％，其次為煙

8、曲霉菌占11.09％。腹水和引流液感染是肝病患者真菌感染的特點，分離率為13.91％，感染種類以白假絲酵母菌為主(8.32％)。從我院近四年的真菌藥敏結果分析，絲狀真菌的耐藥率普遍高于酵母樣真菌(p＜0.05)，酵母樣真菌對氟康唑、兩性霉素、伊曲康唑和伏立康唑的耐藥率分別為11.96％，2.54％，1.96％和0.69％;絲狀真菌對氟康唑、兩性霉素、伊曲康唑和伏立康唑的耐藥率分別為95.97％，17.29％，6.05％和4.61％。

9、r>　　本研究對327株真菌的質譜鑒定結果顯示，依照其評分標準質譜儀鑒定酵母樣真菌評分達到種水平（評分＞2.0）的鑒定率為90.31％，達到屬水平（評分＞1.7）的為98.68％。絲狀真菌評分達到種水平的鑒定率為74％，達到屬水平的為94％。對臨床常見的曲霉菌的鑒定正確率可以達到96.74％。質譜儀還能從種內對真菌進行更細致的分型，例如可準確的將近平滑假絲酵母菌，似平滑假絲酵母菌和擬平滑假絲酵母進行區(qū)分。對單一種類真菌感染的陽性培養(yǎng)瓶，

10、質譜從培養(yǎng)瓶中直接提取菌種蛋白鑒定的結果與培養(yǎng)后用菌落鑒定的結果相同，這可以把體液真菌感染的鑒定時間提前24h。本研究通過對現有各種真菌鑒定方法用時的比較，發(fā)現質譜儀單株菌鑒定用時僅需20min，并且可同時檢測多株菌，是目前真菌鑒定用時最短，操作也較簡便的方法，為臨床真菌感染的診斷和治療爭取了時間。
　　結論:
　　肝病患者真菌感染的數量和種類有逐年上升的趨勢，臨床要特別重視此類患者腹水、引流液等無菌體液的感染，加強對各種留

11、置管的護理，對各種介入性治療要嚴格無菌操作。應根據微生物實驗室的菌種鑒定和藥敏結果合理進行抗真菌治療，并且要考慮到藥物對肝臟的毒性，慎重選擇抗真菌藥物。質譜儀在鑒定真菌的種屬水平上都達到了理想的結果，尤其鑒定酵母樣真菌和曲霉菌的能力更為突出，完全滿足臨床微生物實驗室真菌檢測的需求。質譜儀在真菌感染診斷方面有廣闊的臨床應用前景，對于不常見的真菌，各驗室可以根據自己醫(yī)院患者真菌感染的特點，建立個性化的數據庫，提高真菌檢測時效和準確性，更好的