2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、目的:
  本實(shí)驗(yàn)通過探索建立小鼠EAU動(dòng)物模型,對比研究MSCs及阻斷CD73功能的MSCs對EAU的治療效果,觀察臨床、病理表現(xiàn)及視網(wǎng)膜功能改變,明確CD73在MSCs免疫調(diào)節(jié)過程中的重要作用。另外,檢測小鼠脾臟及頸部引流淋巴結(jié)中T淋巴細(xì)胞增殖能力及分化情況,并分析MSCs對T淋巴細(xì)胞表面CD73表達(dá)的影響,以闡明MSCs通過CD73/腺苷信號對EAU進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)的作用機(jī)制。最終進(jìn)一步完善MSCs的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制網(wǎng)絡(luò),為臨床應(yīng)用

2、MSCs治療葡萄膜炎等自身免疫性疾病提供新的方法和理論基礎(chǔ)。
  方法:
  1.MSCs培養(yǎng):C57BL/6小鼠脂肪來源MSCs的分離、培養(yǎng)與鑒定,人脂肪來源MSCs的分離、培養(yǎng)。
  2.建立EAU動(dòng)物模型:過繼轉(zhuǎn)移IRBP1-20抗原特異性T淋巴細(xì)胞至C57BL/6小鼠建立過繼轉(zhuǎn)移EAU動(dòng)物模型。
  3.MSCs預(yù)處理:在MSCs體外培養(yǎng)體系中加入CD73競爭性抑制劑APCP,過夜,待用。
  4.

3、MSCs治療:過繼免疫后第10天,PBS對照組、MSCs治療組及經(jīng)APCP預(yù)處理的MSCs治療組分別行單次尾靜脈注射1ml無菌PBS、MSCs單細(xì)胞懸液或經(jīng)APCP預(yù)處理的MSCs單細(xì)胞懸液。
  5.臨床觀察:過繼免疫后第8天至60天,隔日觀察EAU小鼠眼底發(fā)病情況,并根據(jù)Caspi臨床分級評分。
  6.組織病理學(xué)觀察:過繼免疫后第60天,處死各組小鼠,制備視網(wǎng)膜組織切片,行組織病理學(xué)觀察,并根據(jù)Caspi病理分級評分。

4、
  7.視網(wǎng)膜功能檢測:過繼免疫后第25、35、45、60天分別對各組小鼠進(jìn)行ERG檢測,評價(jià)視網(wǎng)膜功能。
  8.5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine,Brdu)測定T細(xì)胞增殖:過繼轉(zhuǎn)移后第21天,取各組EAU小鼠脾臟和引流淋巴結(jié)T細(xì)胞,在0、1、10、30μg/ml IRBP1-20抗原刺激下培養(yǎng),Brdu法檢測體內(nèi)T細(xì)胞增殖指數(shù)。另外,取過繼轉(zhuǎn)移后第21天模型對照組EAU小鼠脾臟和引流淋

5、巴結(jié)細(xì)胞,將MSCs或經(jīng)APCP預(yù)處理的MSCs與T淋巴細(xì)胞按1:5、1:10、1:20混合培養(yǎng),在CD39抑制劑POM-1、CD73抑制劑APCP或A2A腺苷受體拮抗劑SCH58261干預(yù)下,Brdu法檢測體外T細(xì)胞增殖指數(shù)。
  9.T細(xì)胞分化檢測:過繼轉(zhuǎn)移后第21天,取模型對照組EAU小鼠脾臟和引流淋巴結(jié)T細(xì)胞,與MSCs或經(jīng)APCP預(yù)處理的MSCs混合培養(yǎng),應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析CD4+IL-17+細(xì)胞及CD4+Foxp3+細(xì)

6、胞比例。
  結(jié)論:
  10.MSCs表面CD73功能檢測:應(yīng)用孔雀綠比色實(shí)驗(yàn)及高效液相色譜法檢測CD73的核苷酸外切酶功能及MSCs培養(yǎng)上清中腺苷的生成量。
  11. T細(xì)胞表面CD73表達(dá)變化檢測:過繼轉(zhuǎn)移后第21天,取模型對照組EAU小鼠脾臟和引流淋巴結(jié)T淋巴細(xì)胞,與MSCs共培養(yǎng)或在MSCs分泌的各種細(xì)胞因子干預(yù)下混合培養(yǎng),流式細(xì)胞儀檢測各組活化的CD4+T淋巴細(xì)胞表面CD73的表達(dá)差異。
  結(jié)果:

7、
  1.成功分離培養(yǎng)小鼠脂肪來源MSCs及人脂肪來源MSCs,并鑒定。
  2.成功建立小鼠過繼免疫EAU模型。
  3.臨床觀察顯示,MSCs治療組臨床評分較空白對照組顯著降低(P<0.05),而經(jīng)APCP預(yù)處理的MSCs治療組臨床評分顯著高于MSCs治療組(P<0.05)。
  4.組織病理學(xué)觀察顯示,MSCs療法顯著減輕視網(wǎng)膜組織損傷(P<0.05)。經(jīng)APCP預(yù)處理的MSCs對于視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)的保護(hù)作用大大

8、減弱(P<0.05)。
  5.視網(wǎng)膜功能檢測顯示,MSCs療法對EAU小鼠的視網(wǎng)膜功能具有顯著的保護(hù)作用(P<0.05),而經(jīng)APCP預(yù)處理的MSCs對視網(wǎng)膜功能的保護(hù)作用大大降低(P<0.05)。
  6.T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示,MSCs可顯著抑制IRBP1-20抗原特異性 T細(xì)胞增殖(P<0.05)。而經(jīng)APCP預(yù)處理的MSCs對T細(xì)胞的增殖抑制能力大幅減弱(P<0.05)。當(dāng)CD39/CD73/腺苷通路上任何環(huán)節(jié)被阻斷,

9、T細(xì)胞均可呈現(xiàn)顯著增殖。
  7. T細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)顯示,MSCs共培養(yǎng)可明顯提高CD4+T細(xì)胞中Foxp3+T細(xì)胞相對于IL-17+T細(xì)胞的比例(P<0.05)。
  8.孔雀綠比色實(shí)驗(yàn)及高效液相色譜法檢測顯示,MSCs表面CD73具有核苷酸外切酶的功能,可將AMP降解為腺苷,APCP可顯著抑制其功能(P<0.05)。
  9. T細(xì)胞表面CD73表達(dá)差異檢測顯示,MSCs共培養(yǎng)可上調(diào)活化T細(xì)胞表面CD73的表達(dá)水平(

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