環(huán)磷酸腺苷在大鼠胰島素分泌中的作用及其機制.pdf

1、目的：
　　探討腺苷酸環(huán)化酶(AC)/環(huán)磷酸腺苷(cAMP)信號轉導通路在大鼠胰島素分泌中的作用，通過使用AC激動劑Forskolin和抑制劑SQ22536研究cAMP影響胰島素分泌的機制。
　　方法：
　　(1)處死大鼠，打開大鼠腹腔，將膠原酶P(Collagenase P)液從胰總管打入胰腺，可看到附著在胃和小腸的胰腺，迅速剪下胰腺，將其放到38℃水浴震蕩消化11 min，采用Histopaque-1077，離心分

2、離出大鼠胰島。用DispaseⅡ消化胰島，可得到大鼠原代胰島β細胞，為了使研究結果最為接近大鼠生理狀態(tài)，以上方法分得的胰島和細胞最多使用7天。(2)DTZ染液可將胰島染成猩紅色，對其進行染色鑒定，室溫下染色胰島10分鐘，在光學顯微鏡下觀察胰島形態(tài)。對胰島進行活性檢測可用AO/PI染液孵育胰島，用490 nm激發(fā)光，510 nm發(fā)射光觀察。(3)得到的胰島在37℃細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，用放射性免疫分析法檢測AC激動劑Forskolin和抑制劑S

3、Q22536對大鼠胰島素分泌及環(huán)磷酸腺苷(cAMP)含量的影響。(4)采用膜片鉗技術檢測藥物對胰島β細胞電壓依賴性鉀通道(KV)、動作電位(AP)的影響。(5)采用離子成像技術檢測Forskolin和SQ22536對胰島β細胞內鈣離子濃度的影響。
　　結果：
　　(1)用膠原酶P，Histopaque-1077梯度離心法分得的胰島，大小不一，折光性好，直徑在100-300μm。胰島β細胞細胞呈球形，質地光滑，表面圓潤。(2)

4、胰島經(jīng)DTZ染色成猩紅色，顯示在以上實驗中分離為胰島，且純度較高。95％以上的胰島經(jīng)AO/PI染色后發(fā)綠色熒光，胰島活性好。(3)在胰島素分泌實驗中，胰島有明顯的葡萄糖依賴性的促胰島素分泌作用；在不同葡萄糖濃度下胰島素分泌的標化值分別是：(1.00±0.38)用特異的AC激動劑Forskolin和廣泛應用的AC抑制劑SQ22536，在8.3mM葡萄糖的基礎上，F(xiàn)orskolin增加了胰島素分泌（8.3 G,n=6vs8.3G+Forsk

5、olin，10μM，n=6，P<0.05）；(4)在有SQ2253610μ的作用下，可以阻斷Forskolin增加胰島素分泌的作用(8.3G+Forskolinvs8.3G+SQ22536+Forskolin，10μM，n=6，P<0.05)。(5)在 cAMP量檢測試驗中，所測 cAMP值分別為2.8G組999.68±95.82fmol/10islets/hr，8.3G組1021.77±73.73fmol/10islets/hr,8.

6、3G+SQ22536組1187.23±133.13fmol10islets/hr，8.3G+Forskolin組3682.14±395.38fmol/10islets/hr，8.3G+SQ22536+Forskolin組2947.21±157.63 fmol/10islets/hr。Forskolin增加了胰島β細胞內生物合成的cAMP(8.3G n=6 vs8.3G+Forskolin，10μM，n=6，P<0.01)；同時cAMP的

7、量沒有影響(8.3Gvs8.3G+SQ22536,10μM, n=6, P＞0.05)；但是SQ22536可以部分阻斷Forskolin增加了胰島β細胞內生物合成的cAMP的量(8.3G+Forskolin,10μM, n=6vs8.3G+SQ22536+Forskolin,10μM, n=6, P<0.05)。(6)通過膜片鉗實驗看出，KV通道的開放可被Forskolin極大地抑制，減小KV電流，同樣的情況下SQ22536對KV電流沒

8、有影響，而給予Forskolin+SQ22536加藥刺激，則可以發(fā)現(xiàn)SQ22536部分阻斷Forskolin抑制 KV通道開放的作用。在80mV的刺激時，記錄電流密度為Forskolin(n=6,76.67±2.78pA/pF)，SQ22536+Forskolin(n=6,109.89±4.58pA/pF)與對照組(n=6,139.62±4.54pA/pF)相比明顯地抑制 KV電流；Forskolin(n=6,76.67±2.78pA/

9、p)與SQ2253+Forskolin(n=6,109.89±4.58pA/pF)相比有統(tǒng)計學差異；而SQ22536(n=6,132.43±2.78pA/pF)對KV的影響無統(tǒng)計學差異。在二甲基亞砜DMSO加藥組與對照組的比較中，尚未發(fā)現(xiàn)DMSO對KV通道有影響。(7)使用膜片鉗檢測動作電位時程(APD)，F(xiàn)orskolin加藥組(70.28±5.18ms,10μM，n=8)相比較對照組(40.61±3.77ms, n=8)，p<0.0

10、1；Forskolin+SQ22536加藥組(52.73±2.19,10μM，n=8)與Forskolin加藥組比較，可以減少Forskolin對動作電位的延長，p<0.05。(8)在離子成像試驗中得到，在低葡萄糖濃度，尚未發(fā)現(xiàn)Forskolin(10μM, n=8)可以使細胞內的鈣離子濃度有變化。在高糖的基礎上，給予 Forskolin(10μM, n=8)的刺激，發(fā)現(xiàn)對細胞內的鈣離子濃度的變化有顯著影響；同樣條件，先給予SQ2253

11、6(SQ,10μM，n=8)的加藥刺激，未見明顯變化，持續(xù)一段時間以后，接著給細胞 Forskolin(FSK,10μM, n=8)的刺激。
　　結論：
　　(1)梯度分離法分離純化胰島，消化得到的胰島β細胞狀態(tài)良好。(2)實驗中分得的胰島DTZ染色顯示純度高，AO/PI染色說明活性良好。(3)在正常生理狀態(tài)下，胰島功能好。Forskolin有促胰島素分泌作用，可被SQ22536所減弱，而SQ22536對胰島素分泌沒有影響，

12、說明胰島素分泌量被cAMP所增加。(4)加入藥物Forskolin能使細胞內的cAMP含量明顯升高，且Forskolin升高cAMP的作用可以被SQ22536削減。(5) Forskolin明顯抑制KV通道，而這種作用可被SQ22536所消除，說明cAMP會影響KV通道的開放和閉合。(6) Forskolin顯著延長ADP，SQ22536可以縮短Forskolin對AP時程的延長，說明增加細胞內cAMP的量可以延長APD。(7)胰島細胞

13、內的鈣離子濃度在加入Forskolin后明顯增加了， SQ22536能夠消弱Forskolin升高鈣離子濃度的作用。綜上所述，在胰島β細胞上通過使用AC激動劑Forskolin增加細胞內在cAMP的生物合成，cAMP可以抑制KV通道的開放，使APD作用延長，使鈣離子進入到細胞內的時間延長，使細胞內的鈣離子濃度顯著增多，最終使胰島素的分泌的量增加；在加入藥物 SQ22536，尚未發(fā)現(xiàn)該藥其本身對胰島素分泌及KV電流有影響，但該藥可以阻斷F