氧化型ATM對(duì)乳腺癌CAFs增殖和能量代謝重塑的調(diào)控作用及其機(jī)制研究.pdf

1、本研究分為二部分：
　　第一部分：氧化型ATM對(duì)乳腺癌CAFs細(xì)胞增殖的調(diào)控作用及其機(jī)制研究
　　目的：探討氧化型ATM對(duì)乳腺癌CAFs增殖的調(diào)控作用及其機(jī)制。
　　方法：
　?、乓哉n題組前期構(gòu)建的永生化乳腺癌NFs和CAFs為模型，采用MTT法、生長(zhǎng)密度實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞分析和蛋白印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)乳腺癌CAFs的異常增殖行為。
　?、频鞍子≯E、細(xì)胞免疫熒光和免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)乳腺癌NFs和CAFs中p-ATM（s1

2、981）、ATM和γH2AX（s139）的蛋白表達(dá)量。各種ROS抑制劑處理乳腺癌CAFs，DCFH熒光探針實(shí)驗(yàn)檢測(cè)乳腺癌CAFs中ROS含量改變，蛋白印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CAFs細(xì)胞ATM氧化活化的改變。
　?、菓?yīng)用ATM特異抑制劑KU60019和siRNA技術(shù)抑制乳腺癌CAFs中氧化型ATM功能，觀察氧化型ATM功能缺失對(duì)乳腺癌CAFs增殖的作用。
　?、扔肒U60019和NAC同時(shí)處理乳腺癌CAFs，分析NAC對(duì)ATM功能缺失所

3、致CAFs增殖缺陷的影響。
　?、墒褂肒U60019處理CAFs，蛋白印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)KU60019對(duì)MEK-MAPK、PI3K-AKT和WNT信號(hào)通路活性的影響。采用U0126、LY294002和XAV939抑制劑處理CAFs，檢測(cè)MEK-MAPK、PI3K-AKT和WNT信號(hào)通路失活對(duì)CAFs增殖的作用。
　?、视肒U60019、U0126、LY294002和 XAV939處理CAFs，蛋白印跡檢測(cè)ATM功能、MEK-MAP

4、K、PI3K-AKT和WNT信號(hào)通路失活對(duì)CAFs中GSK3β、β-catenin和c-Myc蛋白表達(dá)的影響。同樣條件下，ChIP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)處理前后CAFs細(xì)胞β-catenin轉(zhuǎn)錄活性的改變。運(yùn)用siRNA技術(shù)敲除CAFs中c-Myc，觀察c-Myc敲除對(duì)CAFs增殖的影響。
　　結(jié)果：
　?、臡TT實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞密度實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞分析和蛋白印跡實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，與NFs相比，CAFs增殖速度快、生長(zhǎng)密度大、S期細(xì)胞比例高以及細(xì)胞

5、增殖正向調(diào)控蛋白表達(dá)升高，這說(shuō)明乳腺癌CAFs具有異常增殖表型。
　?、婆cNFs相比，CAFs中p-ATM（s1981）、ATM和p-AKT（s473）蛋白表達(dá)升高，γH2AX（s139）蛋白表達(dá)無(wú)變化。在各種ROS抑制劑處理下，只有NAC、DPI和rotenone能降低CAFs細(xì)胞中的ROS水平和p-ATM（s1981）蛋白表達(dá)量。
　?、桥c對(duì)照相比，KU60019抑制或ATM基因敲除明顯抑制CAFs增殖速率、降低CAFs

6、生長(zhǎng)密度、減少CAFs S期細(xì)胞比例、抑制細(xì)胞增殖正向調(diào)控蛋白表達(dá)，這說(shuō)明氧化型ATM具有促CAFs增殖作用。
　?、扰c溶劑對(duì)照相比，NAC能逆轉(zhuǎn)KU60019處理所致CAFs細(xì)胞OS，但僅能小部分逆轉(zhuǎn)KU60019所導(dǎo)致的CAFs增殖缺陷。
　?、傻鞍子≯E實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，KU60019顯著抑制CAFs中ERK-MAPK、PI3K-AKT和WNT信號(hào)通路活性。與溶劑對(duì)照相比，U0126、LY294002和XAV939單獨(dú)或聯(lián)合

7、處理抑制CAFs增殖。
　?、实鞍子≯E實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，KU60019、U0126、LY294002和XAV939均能增強(qiáng)GSK3β激酶活性，抑制β-catenin和c-Myc蛋白表達(dá)。ChIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，KU60019、U0126、LY294002和XAV939均能阻斷β-catenin轉(zhuǎn)錄活性。與對(duì)照相比，c-Myc敲除能抑制CAFs增殖。
　　結(jié)論：
　?、排c乳腺癌NFs細(xì)胞相比，乳腺癌CAFs具有異常增殖表型。<

8、br>　　⑵乳腺癌CAFs中存在非DSBs依賴性ATM氧化活化現(xiàn)象。
　?、茄趸虯TM促乳腺癌CAFs增殖。
　?、妊趸虯TM氧化還原維持功能對(duì)乳腺癌CAFs增殖調(diào)控作用有限。
　?、裳趸虯TM主要通過(guò)增強(qiáng)ERK-MAPK，PI3K-AKT和WNT信號(hào)通路活性促進(jìn)乳腺癌CAFs細(xì)胞增殖。
　　⑹β-Catenin/c-Myc軸介導(dǎo)氧化型ATM促CAFs增殖功能。
　　第二部分：氧化型ATM對(duì)低氧乳腺癌

9、CAFs細(xì)胞EMR的調(diào)控作用及其機(jī)制研究
　　目的：研究氧化型ATM對(duì)低氧乳腺癌CAFs細(xì)胞EMR的調(diào)控作用及其機(jī)制。
　　方法：
　　⑴分析乳腺癌CAFs/NFs mRNA表達(dá)芯片，挖掘乳腺癌CAFs細(xì)胞中異常表達(dá)的能量代謝相關(guān)基因，qRT-PCR法驗(yàn)證。與常氧NFs相比，葡萄糖消耗速率、乳酸產(chǎn)生速率、蛋白印跡、線粒體活性和電鏡等實(shí)驗(yàn)檢測(cè)低氧對(duì)CAFs EMR的影響。
　　⑵與溶劑對(duì)照相比，探討抗氧化劑NAC和

10、線粒體呼吸鏈復(fù)合酶體Ⅲ抑制劑rotenone對(duì)低氧CAFs EMR的影響。
　?、且匀軇閷?duì)照，蛋白印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NAC和rotenone對(duì)低氧CAFs ATM氧化活化的作用。用KU60019處理CAFs，探討氧化型ATM功能缺失對(duì)低氧CAFs EMR的影響。
　　⑷采用磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)和生物信息學(xué)技術(shù)篩選低氧CAFs氧化型ATM下游潛在的能量代謝相關(guān)底物。
　　結(jié)果：
　　⑴mRNA芯片和qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)

11、果顯示，在乳腺癌CAFs中，許多糖酵解基因表達(dá)上調(diào)，很多OP基因表達(dá)下調(diào)，能量代謝相關(guān)信號(hào)通路異常活化。與常氧NFs相比，低氧CAFs的葡萄糖消耗速率和乳酸產(chǎn)生速率明顯升高，促能量代謝蛋白表達(dá)上調(diào)，線粒體活性被嚴(yán)重抑制，線粒體嵴和數(shù)量顯著減少。這表明低氧誘導(dǎo)CAFs細(xì)胞具有典型的EMR表型。
　?、芌OS水平檢測(cè)、蛋白印跡和代謝實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NAC和rotenone抑制低氧CAFs細(xì)胞ROS升高和EMR。
　?、堑鞍子≯E實(shí)驗(yàn)

12、的結(jié)果顯示，NAC和rotenone抑制低氧CAFs ATM的氧化活化。蛋白印跡和代謝實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，氧化型ATM功能喪失抑制低氧乳腺癌CAFs EMR。這表明，氧化型ATM具有促進(jìn)低氧CAFs EMR功能。
　?、攘姿峄鞍踪|(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)和生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，低氧CAFs細(xì)胞氧化型ATM下游具有許多新的潛在的能量代謝相關(guān)底物。
　　結(jié)論：
　　⑴低氧誘導(dǎo)乳腺癌CAFs產(chǎn)生典型的EMR表型。
　?、凭€粒體來(lái)源的R