鈣通道CACNA1C基因突變致心原性猝死相關(guān)早期復(fù)極的分子遺傳學(xué)機制探討.pdf

1、心原性猝死（sudden cardiac death, SCD）是人類健康頭號殺手心血管疾病導(dǎo)致的突發(fā)性自然死亡。在諸多SCD高發(fā)的心血管疾病中，具有極高風(fēng)險尤其對年輕人造成危害的遺傳性心律失常綜合征日漸受到關(guān)注。主要由各種離子通道蛋白及其調(diào)控蛋白編碼基因突變導(dǎo)致的遺傳性心律失常綜合征通常不伴心臟結(jié)構(gòu)功能異常，而呈現(xiàn)以各種特征性的心電圖形態(tài)，在特殊環(huán)境狀態(tài)下誘發(fā)嚴(yán)重的心電生理活動紊亂促使惡性心律失常發(fā)生，從而導(dǎo)致SCD。
　　早期

2、復(fù)極（early repolarization, ER）是部分心肌提前復(fù)極形成心電圖上J點抬高和非心肌缺血性ST段抬高的特殊波形，在人群中廣泛存在，且在半個世紀(jì)以來被認(rèn)為是一種正常的心電圖表現(xiàn)。隨著流行病學(xué)調(diào)查研究的大力開展，部分有ER表現(xiàn)的人群被發(fā)現(xiàn)存在SCD風(fēng)險及家族聚集現(xiàn)象。如何辨別具有SCD風(fēng)險的ER表現(xiàn)成為臨床醫(yī)生所面臨的棘手問題。在最新的遺傳性心律失常綜合征診治共識中，這類具有惡性心律失常病史或SCD家族史且心臟結(jié)構(gòu)正常，≧

3、2個連續(xù)下壁和/或側(cè)壁導(dǎo)聯(lián)出現(xiàn)J點抬高≧1 mm心電圖表現(xiàn)的一組臨床癥候群被定義為早期復(fù)極綜合征（earl repolarization syndrome, ERS）。
　　近年來分子遺傳學(xué)理論和技術(shù)的飛速發(fā)展極大地推動了人們對遺傳性心律失常綜合征中各類疾病的認(rèn)知與探索。編碼 ATP敏感性鉀離子通道 Kir6.1的KCNJ8和 ABCC9基因，編碼 L型鈣離子通道的 CACNA1C、CACNB2b和CACNA2D1基因，以及編碼鈉

4、離子通道的SCN5A基因突變相繼在ERS中報道。突變導(dǎo)致的外向鉀離子通道功能增強和內(nèi)向鈣離子或鈉離子通道功能減弱被認(rèn)為是ERS的病理性致病基礎(chǔ)。ER不同于長QT綜合征和Brugada綜合征等其它具有顯著遺傳學(xué)特性的遺傳性心律失常綜合征類型，ERS致病基因突變多見于散發(fā)病例，具有家族遺傳性的基因突變罕見。此外，國人ERS的遺傳學(xué)研究報道罕見，由此可見國人相關(guān)致病基因突變的研究仍存在很大空間，對有明顯癥狀或猝死家族史的家系進行級聯(lián)式遺傳學(xué)篩

5、查才能高效地篩查致病基因突變，并探索ERS分子遺傳學(xué)發(fā)病機制，從而尋找更加有效的ERS個體化治療方案。
　　第一部分心原性猝死大家系臨床分析及遺傳學(xué)檢測
　　目的：
　　本研究通過對所收集的 SCD大家系先證者及存活成員進行全面的臨床評估，并對先證者尸檢報告仔細(xì)分析以及家系成員SCD候選基因篩查檢測，解析該家系SCD發(fā)生機制，以異常心電圖表現(xiàn)為線索尋找潛在的致死性原因及致病基因突變，為該家系SCD高危成員提供診療建議。

6、
　　方法：
　　1.臨床資料收集：嚴(yán)格遵循醫(yī)學(xué)倫理準(zhǔn)則，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批獲準(zhǔn)及入選研究對象知情同意，對我院心內(nèi)科就診的江西籍SCD高危患者及其親屬臨床資料進行采集。診斷標(biāo)準(zhǔn)參考2013年由美國心律協(xié)會（Heart Rhythm Society, HRS）、歐洲心律學(xué)會（European Heart Rhythm Association, EHRA）和亞太心律協(xié)會（Asia Pacific Heart Rhythm So

7、ciety, APHRS）共同制定的遺傳性心律失常綜合征患者診斷和治療專家共識，獲取家系成員病史，心電圖和心臟彩超等檢查信息。
　　2.尸檢資料收集：在SCD死者法定代理人知情同意的情況下，獲取死者經(jīng)司法機構(gòu)提供的尸檢報告及相關(guān)病理組織。
　　3.先證者心肌組織 HE染色：取死者心肌不同部位組織塊制作切片并 HE染色，觀察心肌組織結(jié)構(gòu)形態(tài)。
　　4.遺傳學(xué)檢測：經(jīng)患者及其家屬知情同意后，采集外周靜脈全血5 ml儲存于E

8、DTA真空抗凝管，采用血液基因組DNA提取試劑盒抽提外周血白細(xì)胞全基因組DNA，選擇常見的遺傳性心律失常綜合征致病基因作為候選基因，包括編碼鈉離子通道的SCN5A、SCN1B、SCN3B和GPA1L基因，編碼鉀離子通道的KCNQ1、KCNH2、KCNJ8、KCNE1、KCNE2和 KCND3基因，編碼鈣離子通道的CACNA1C、CACNB2b和CACNA2D1基因以及編碼通道調(diào)節(jié)蛋白的ANK2和PRKAG2基因，設(shè)計相應(yīng)引物，使所測范圍

9、涵蓋待測基因所有外顯子以及外顯子與內(nèi)含子交界區(qū)序列，采用DNA直接測序法（雙脫氧鏈終止法）進行測序篩查基因變異，隨機選取本實驗室DNA庫中400例相同遺傳背景及年齡性別匹配的正常健康人群標(biāo)本作為對照，以發(fā)現(xiàn)新的致病基因突變位點或單核苷酸多態(tài)性（single-nucleotide polymorphisms, SNPs）。
　　5.統(tǒng)計學(xué)分析：所有涉及統(tǒng)計的實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS19.0軟件包統(tǒng)計學(xué)分析軟件進行分析。計量資料以均數(shù)±

10、標(biāo)準(zhǔn)誤（-x±s）表示，兩組間比較采用 t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），P值＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義，P值＜0.01具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.本研究收集到一個原因不明夜間猝死大家系，死者為包含先證者在內(nèi)的5名男性成員，先后在睡眠中發(fā)生猝死，均處青壯年時期，最小23歲，最大49歲，平均年齡34±8.4歲。
　　2.先證者尸檢報告提示無機械性損傷、機械性窒息致死的法醫(yī)病理

11、學(xué)改變，也無中毒致死的依據(jù)；組織病理學(xué)檢查結(jié)果排外各主要器官器質(zhì)性病變，考慮猝死可能由心原性因素所致。所取心肌組織形態(tài)結(jié)構(gòu)及排列均正常，可排外心肌病等各種結(jié)構(gòu)性心臟病以及可伴右室心肌病變的Brugada綜合征。先證者死前3年內(nèi)偶發(fā)頭暈、心悸，無胸悶、胸痛及暈厥；既往心臟彩超檢查無明顯異常，24小時3導(dǎo)聯(lián)動態(tài)心電圖記錄II導(dǎo)聯(lián)和aVF導(dǎo)聯(lián)J點抬高≧1.5mm。
　　3.其他家庭成員既往史及個人史無特殊，無陽性體征，靜息心電圖、心臟彩

12、超及平板運動試驗檢查未見明顯異常。24 h動態(tài)心電圖檢查發(fā)現(xiàn)3位家庭成員有ER表現(xiàn)。其中先證者弟弟ER表現(xiàn)最為顯著，下壁II、III和aVF導(dǎo)聯(lián)，胸前V3~V5導(dǎo)聯(lián)J點抬高0.05 mV~0.3 mV，且可見J波，V2~V4導(dǎo)聯(lián)T波高尖。先證者兒子及其弟弟女兒的動態(tài)心電圖表現(xiàn)為下壁和側(cè)壁導(dǎo)聯(lián)ST段抬高。
　　4.通過候選基因測序篩查發(fā)現(xiàn)該家系1個鈣離子通道α1亞單位編碼基因CACNA1C的雜合錯義突變，由第48號外顯子上第5747

13、號堿基A轉(zhuǎn)換為堿基G，導(dǎo)致第1916位谷氨酰胺變?yōu)榫彼?，即p.Q1916R。該突變見于先證者及源于父系的所有一級和二級親屬，而其母親及母親的兄弟姐妹和其他與先證者無血緣關(guān)系的家庭成員均不存在此突變。此外，在家系中還篩查到已被報道的5個CACNA1C基因SNPs，分別為c.2436C>T（p.D812D），c.3786C>T（p.F1262F）， c.5361G>A（p.T1787T），c.5609C>T（p.T1870M）和 c.56

14、49G>A（p.P1883P），以及1個SCN5A基因SNPs，c.3578G>A（p.R1193Q）。
　　5. CACNA1C-Q1916R突變攜帶者中有ER表現(xiàn)和無ER表現(xiàn)成員心電圖參數(shù)比較結(jié)果顯示，有ER表現(xiàn)成員的心率校正QT間期比無ER表現(xiàn)的成員短，但均在正常范圍，QT間期離散度（QT dispersion，QTd）和Tp-Te間期離散度（Tp-Te dispersion，Tp-ed）則更大，但兩組間各參數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意

15、義。
　　結(jié)論：
　　1.本研究從一個青壯年男性SCD高發(fā)大家系，揭示SCD可能與ERS相關(guān)。
　　2. ERS致病基因CACNA1C-Q1916R新突變可能與該家系ERS致SCD相關(guān)。
　　3. CACNA1C-Q1916R突變攜帶家庭成員中 ER呈不完全外顯性，考慮與SCN5A-R1193Q和性別相關(guān)。
　　4. ER家庭成員心電圖中有致惡性心律失常性作用的復(fù)極化跨壁離散度參數(shù)指標(biāo)QTd和Tp-ed增大

16、，但與無ER表現(xiàn)的CACNA1C突變攜帶成員比較無統(tǒng)計學(xué)差異，樣本量有限是可能原因。
　　5.其它所發(fā)現(xiàn)的CACNA1C基因SNPs（D812D、F1262F、T1787T、T1870M和P1883P）無明顯致SCD效應(yīng)。
　　第二部分 CACNA1C基因突變致心原性猝死相關(guān)ER的分子遺傳學(xué)、細(xì)胞電生理機制及藥物干預(yù)探討
　　目的：
　　從組織和細(xì)胞水平探討CACNA1C-Q1916R突變的功能變化及致SCD相關(guān)

17、ER的分子機理，并篩選有效的治療藥物。
　　方法：
　　1.人心肌組織標(biāo)本免疫組化：取攜帶CACNA1C基因突變先證者左心室肌組織，通過免疫組化法對組織內(nèi)由CACNA1C基因翻譯的Cav1.2蛋白表達(dá)及定位進行檢測，并以成年人正常左心室標(biāo)本作為對照。
　　2. CACNA1C-Q1916R定點突變：采用經(jīng)典的定點突變技術(shù)，將CACAN1C基因第5747位堿基A突變?yōu)閴A基G，進行測序驗證并排除其它位點突變。
　　3

18、. CACNA1C質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染：采用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒，將攜帶野生和突變型CACNA1C，以及野生型CACNB2b和CACNA2D1基因的質(zhì)粒載體按摩爾濃度1:1:1分兩組共轉(zhuǎn)染入人胚腎293細(xì)胞（human embryonic kidney293, HEK293）中用于后續(xù)實驗，用于膜片鉗細(xì)胞電生理實驗的細(xì)胞則按0.3比例額外轉(zhuǎn)染表達(dá)綠色熒光的pEGFP-N3質(zhì)粒。
　　4.實時熒光定量 PCR（ Qu

19、antitative Real time PCR, qRT-PCR）：采用qRT-PCR引物擴增表達(dá)野生和突變型CACNA1C的HEK293細(xì)胞中 CACNA1C的序列片段，檢測突變對Cav1.2總mRNA表達(dá)的影響。
　　5.蛋白免疫印跡（Western Blot）：采用Western Blot檢測表達(dá)野生和突變型CACNA1C的HEK293細(xì)胞中，Cav1.2在細(xì)胞總蛋白、膜蛋白和漿蛋白各水平的表達(dá)情況。
　　6.細(xì)胞免

20、疫熒光：在共聚焦熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染野生和突變型CACNA1C并經(jīng)Cav1.2特異抗體熒光染色的HEK293細(xì)胞，檢測突變對Cav1.2表達(dá)定位及轉(zhuǎn)運的影響。
　　7.全細(xì)胞膜片鉗細(xì)胞電生理分析及藥物篩選：采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄表達(dá)突變型CACNA1C的HEK293細(xì)胞上L型鈣離子流變化，以及雄激素睪酮（10μM）對其的影響。再分別加入ER治療藥物異丙腎上腺素（10μM）和奎尼丁（5μM），觀察藥物對鈣離子流的影響，繪制電流-電

21、壓（I-V）曲線，電壓依賴的穩(wěn)態(tài)激活曲線(steady state activation, SSA)和電壓依賴的穩(wěn)態(tài)失活曲線(steady state inactivation, SSI)。
　　8.統(tǒng)計學(xué)分析：所有涉及統(tǒng)計的實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS19.0軟件包統(tǒng)計學(xué)分析軟件進行分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（-x±s）表示，兩組間比較采用 t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），P值＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)

22、意義，P值＜0.01具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.成功誘導(dǎo)CACNA1C-Q1916R突變，經(jīng)測序驗證CACAN1C基因第5747位堿基A突變?yōu)閴A基G，其它位點未發(fā)生突變。
　　2.免疫組化結(jié)果顯示攜帶CACNA1C基因突變的先證者心室肌組織Cav1.2蛋白表達(dá)水平低于正常對照組織（*P＜0.05），異源性表達(dá)突變Cav1.2的總mRNA表達(dá)水平較野生型Cav1.2低（*P＜0.01），且在細(xì)胞總蛋白、模蛋

23、白和漿蛋白各水平的表達(dá)均下降（*P＜0.05）。
　　3.細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示突變型Cav1.2蛋白轉(zhuǎn)運功能正常，但整體熒光強度更弱。
　　4.全細(xì)胞膜片鉗結(jié)果顯示突變組鈣電流密度較野生組顯著降低，降低有統(tǒng)計學(xué)意義（*P＜0.05，**P＜0.01），SSA和SSI兩組間無差異；睪酮（10μM）可顯著降低突變組電流密度，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＃P＜0.05）；ERS治療藥物異丙腎上腺素（10μM）可增加野生型鈣電流密度，對突變型

24、鈣電流的增加無統(tǒng)計學(xué)意義，可引起野生型和突變型鈣電流的電壓依賴性SSA均發(fā)生左移；奎尼丁（5μM）對野生型和突變型鈣電流的幅度、密度和電壓依賴性SSA均無任何影響。結(jié)論：
　　1. CACNA1C-Q1916R為功能喪失性突變，可使Cav1.2在mRNA和蛋白質(zhì)水平表達(dá)量均降低，但不影響蛋白的定位及轉(zhuǎn)運，突變可能通過減少細(xì)胞膜上有效Cav1.2數(shù)量而降低鈣電流。
　　2. CACNA1C-Q1916R突變是引起本研究家系中E