TAT-Ag85B蛋白疫苗的優(yōu)化及其免疫效應(yīng)的研究.pdf

1、目的:
　　為獲得大量目的蛋白，對pET28a-TAT-Ag85B質(zhì)粒在E.coli BL21(DE3)中表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，并通過體內(nèi)外實驗觀察表達(dá)蛋白的免疫作用，為結(jié)核病等疾病的防控提供依據(jù)。
　　方法:
　　1.將質(zhì)粒pET28a-TAT-Ag85B轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中，使用異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)TAT-Ag85B融合蛋白表達(dá)，聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定分析。

2、2.分別從誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時間三個方面對蛋白表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化。3.使用His-tag離子親和層析柱分離純化融合蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析蛋白表達(dá)情況，并使用Western blot鑒定。3.分3次皮下注射免疫BALB/c小鼠，末次免疫2周后，ELISA法檢測血清中抗Ag85B滴度，并分別取小鼠脾細(xì)胞與巨噬細(xì)胞，共培養(yǎng)后ELISA法檢測培養(yǎng)液上清中細(xì)胞因子的濃度。
　　結(jié)果:
　　1.經(jīng)酶切鑒定質(zhì)粒轉(zhuǎn)化成功，并

3、且通過SDS-PAGE鑒定誘導(dǎo)后獲得的蛋白為所需目的蛋白。2.通過對照試驗得出使用1mmol/L IPTG在28℃條件下誘導(dǎo)8h是目的蛋白的最佳表達(dá)條件，并且獲得了高表達(dá)的目的蛋白。3.經(jīng)Western blot鑒定，獲得的目的蛋白是所需蛋白TAT-Ag85B。4.ELISA法檢測免疫小鼠血清中抗Ag85B抗體變化情況，發(fā)現(xiàn)TAT-Ag85B組IgG滴度顯著增高。檢測培養(yǎng)液上清中細(xì)胞因子IL-2的分泌情況，借此反應(yīng)巨噬細(xì)胞抗原提呈能力，