卡介苗（BCG）有效成分及Ag85B免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：提取、分離、純化并且鑒定BCG的有效成分，分析BCG不同有效成分及Ag85B對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖作用及誘導(dǎo)小鼠淋巴細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的作用探討卡介苗、其有效組分及Ag85B的免疫調(diào)節(jié)活性。 方法： 1.采用MTT法測(cè)定不同濃度的卡介苗對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖作用。 2.采用ELISA方法檢測(cè)經(jīng)過(guò)不同濃度卡介苗作用后誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IL-2、TNF-α、INF-γ等細(xì)胞因子的含量。 3.采用酶裂解

2、法和超聲波破碎法對(duì)BCG進(jìn)行裂解，提取其活性蛋白成分。 4.采用紫外吸收比色法測(cè)定提取蛋白的純度；應(yīng)用考馬斯亮蘭G250方法測(cè)定提取物的蛋白含量。 5.采用葡聚糖凝膠層析方法對(duì)BCG提取物進(jìn)行組分分離。采用SDS-PAGE凝膠電泳方法對(duì)層析后的BCG提取物進(jìn)行純度及分子量的鑒定。 6.將構(gòu)建的pGESAg85B/BL21活化后接種于LB培養(yǎng)基中，異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)，包涵體變性后經(jīng)梯度

3、濃度尿素復(fù)性,GSTSepharose親和層析、凝血酶切除GST并再次親和層析純化(本過(guò)程均在日本大阪高分子化學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成)。 7.采用MTT法測(cè)定BCG有效提取成分及Ag85B對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖作用，同時(shí)采用ELISA方法檢測(cè)經(jīng)過(guò)BCG有效提取成分及Ag85B誘導(dǎo)作用后小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IL-2、TNF-α、INF-γ等細(xì)胞因子的含量。 8.所得數(shù)據(jù)與BCG的相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 結(jié)論： 1.卡介

4、苗對(duì)于小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生具有促進(jìn)作用，而且，這種作用具有一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。 2.BCG及其有效提取成分和Ag85B對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞都具有促進(jìn)增殖的作用，而且隨著濃度的增加這種促進(jìn)作用不斷增強(qiáng)。當(dāng)卡介苗提取物濃度達(dá)到640μg/ml時(shí)，這種增殖作用最強(qiáng)；Ag85B濃度達(dá)到100μg/ml時(shí)，這種增殖作用最強(qiáng)。比較而言，Ag85B的作用最為顯著。 3.BCG的提取物中的BCGE2及BCGE3對(duì)于小鼠脾