卡介苗分泌型Ag85A在番茄中表達(dá)的研究.pdf

1、研究背景 結(jié)核病一直是威脅人類健康的嚴(yán)重疾病。尤其在發(fā)展中國家，盡管不同程度地推行現(xiàn)代結(jié)核病控制策略，但是結(jié)核病疫情下降緩慢。目前我國約有活動(dòng)性肺結(jié)核病人451萬，涂陽肺結(jié)核病人150萬，菌陽肺結(jié)核病人196萬。從估算的病例數(shù)來看，近10年來，活動(dòng)性肺結(jié)核病人減少了約25％。全人口的結(jié)核感染率為44.5％，也就是說我國有近半的人口(約5.5億人)感染了結(jié)核桿菌，0-14歲兒童的結(jié)核感染率為9.0％。每年約有13萬人死于結(jié)核病，結(jié)

2、核病死亡仍然是其他各種傳染病和寄生蟲病死亡總和的2倍，結(jié)核病死亡平均年齡為55.2歲。 近20年來全球HIV/AIDS的流行加劇了結(jié)核病的疫情，結(jié)核病與HIV/AIDS的共同感染使人類面臨更加嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。結(jié)核病與HIV是潛伏感染期互相激活的危險(xiǎn)因素，二者之間具有互相促進(jìn)的協(xié)同作用，一方增強(qiáng)另一方的進(jìn)展。一方面，受HIV感染后，免疫功能缺陷無力阻止結(jié)核分枝桿菌的生長和局部播散，使結(jié)核病成為HIV感染者中最常見的機(jī)會(huì)性感染和死亡的主

3、要原因。另一方面，受結(jié)核分枝桿菌感染后，其肉芽腫內(nèi)活化的巨噬細(xì)胞所產(chǎn)生的TNF-α(腫瘤壞死因子-α)可激活HIV的繁殖，加速其發(fā)展成為艾滋病。 卡介苗已經(jīng)使用將近100年，它對結(jié)核病的保護(hù)性作用是有限的?？ń槊缒軌驕p少嬰幼兒的結(jié)核病發(fā)病率和死亡率，尤其減少粟粒性結(jié)核與結(jié)核性腦膜炎的發(fā)生，但對成人肺結(jié)核和肺外結(jié)核而言作用甚微，而成人肺結(jié)核是造成結(jié)核病死亡的主要原因，也是結(jié)核病的唯一傳染源。因此，發(fā)展具有流行病學(xué)作用的新疫苗是控制

4、結(jié)核病的首要任務(wù)之一。 抗原85A是分枝桿菌分泌到細(xì)胞外的主要蛋白質(zhì)，有分泌型和成熟型兩種形式，成熟型存在于分枝桿菌細(xì)胞培養(yǎng)濾液中，分泌型存在于細(xì)胞內(nèi)，包括成熟蛋白和一段信號肽。大量研究表明，Ag85A是分枝桿菌的主要保護(hù)性抗原之一。Ag85A的蛋白質(zhì)疫苗、DNA疫苗或表達(dá)Ag85A的重組病毒、BCG疫苗均能誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答，并能抵抗結(jié)核分枝桿菌的侵襲。 植物組織內(nèi)表達(dá)抗原作為一種新興的疫苗生產(chǎn)方法，近年來受到研究者們的

5、重視。很多臨床前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和一些人體實(shí)驗(yàn)顯示，植物組織細(xì)胞中表達(dá)的抗原蛋白質(zhì)能組裝成正確的空間結(jié)構(gòu)，進(jìn)行免疫接種后能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)并具有一定的保護(hù)作用。 因此，該研究選擇分泌型Ag85A的完整編碼基因fbpA為外源目的基因，進(jìn)行黃櫻桃番茄遺傳轉(zhuǎn)化，對其在番茄組織中的表達(dá)進(jìn)行初步研究，為進(jìn)一步深入探索結(jié)核病植物疫苗奠定基礎(chǔ)。 材料與方法 用PCR方法從卡介苗D2株基因組DNA中分離目的基因fbpA，經(jīng)過純化回收

6、將其與克隆載體pUCm-T重組，得到重組體pUCm-T-fbpA后，轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌DH5α中，對轉(zhuǎn)化子和重組體進(jìn)行單菌落PCR、HindⅢ單酶切、BamHI+SacⅠ雙酶切以及DNA序列分析等鑒定。經(jīng)鑒定證實(shí)fbpA基因正確無誤后，從重組體pUCm-T-fbpA中用BamHⅠ+SacⅠ雙酶切下目的基因fbpA，與用相同雙酶切的植物表達(dá)載體pBI121在體外重組以獲得重組體pBI121-fbpA，將重組體轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α細(xì)胞株中進(jìn)

7、行鑒定，經(jīng)過單菌落PCR、BamHⅠ+SacⅠ雙酶切鑒定證實(shí)重組正確后，將重組質(zhì)粒pBI121-fbpA轉(zhuǎn)入土壤根癌農(nóng)桿菌EHA105細(xì)胞株中，經(jīng)過單菌落PCR、從轉(zhuǎn)化子EHA105中提取重組質(zhì)粒pBI121-fbpA擴(kuò)增目的基因等步驟鑒定證實(shí)轉(zhuǎn)化正確后，將攜帶重組體pBI121-fbpA的農(nóng)桿菌株EHA105保存，以備在植物基因轉(zhuǎn)化過程中使用。 選取番茄栽培品種紅櫻桃與黃櫻桃子葉和下胚軸進(jìn)行離體組織培養(yǎng)，以MS培養(yǎng)基作為基本培

8、養(yǎng)基，附加不同濃度的細(xì)胞分裂素ZT和生長素IAA，共組成四組培養(yǎng)基進(jìn)行愈傷組織與芽誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)。對選出的最佳外植體(黃櫻桃番茄子葉)分別進(jìn)行卡那霉素、羧芐青霉素和頭孢霉素敏感性實(shí)驗(yàn)。然后，用攜帶重組質(zhì)粒pBI121-fbpA的農(nóng)桿菌株EHA105懸浮培養(yǎng)液侵染預(yù)培養(yǎng)2天的子葉，菌液OD600約0.3左右，侵染10分鐘。接著在黑暗條件下將侵染過農(nóng)桿菌的子葉共培養(yǎng)3天(在農(nóng)桿菌增殖階段向YEB培養(yǎng)基中添加200uM乙酰丁香酮和5％葡萄糖，在

9、侵染子葉以及共培養(yǎng)階段向MS培養(yǎng)基中添加20uM乙酰丁香酮和5％葡萄糖)。然后，轉(zhuǎn)移子葉到附加10mg/L卡那霉素、500mg/L羧芐青霉素的培養(yǎng)基上進(jìn)行選擇、抑菌培養(yǎng)。待不定芽分化出后切下轉(zhuǎn)移到附加10mg/L卡那霉素、500mg/L頭孢霉素的生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)。待根分化生長后，經(jīng)過一段時(shí)間煉苗，將轉(zhuǎn)化植株逐步從培養(yǎng)室移至普通實(shí)驗(yàn)室，再到室外，最后移栽大田。 取少量轉(zhuǎn)化植株幼葉直接裂解后用上清液作模板對目的基因進(jìn)行擴(kuò)增。然后再提

10、取轉(zhuǎn)化植株總DNA進(jìn)行PCR分析、Southern印跡雜交分析，判斷外源目的基因fbpA是否整合到黃櫻桃番茄染色體DNA中。對經(jīng)過上述鑒定的陽性植株提取果實(shí)總蛋白質(zhì)，用Western印跡雜交分析fbpA基因在番茄組織中的表達(dá)。 結(jié)果 DNA序列分析顯示，fbpA基因有一個(gè)開放閱讀框，共有1014個(gè)堿基組成，上游是一段信號肽編碼區(qū)域，堿基數(shù)為129個(gè)，推測為43個(gè)氨基酸編碼，下游是Ag85A成熟蛋白質(zhì)編碼區(qū)域，堿基數(shù)為88

11、5個(gè)，推測為295個(gè)氨基酸編碼。fbpA基因在卡介苗D2株與1173P2株中的同源性為100％。對重組體pUCm-T-fbpA和DH5α轉(zhuǎn)化子、重組體pBI121-fbpA和DH5α/EHA105轉(zhuǎn)化子進(jìn)行的鑒定均證實(shí)fpbA基因克隆與轉(zhuǎn)化正確。 黃櫻桃番茄與紅櫻桃番茄的子葉、下胚軸在四組培養(yǎng)基中經(jīng)過離體組織培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，只有黃櫻桃番茄子葉的再生頻率最高，出芽率達(dá)到100％，平均11天分化出不定芽，最佳培養(yǎng)基配方為附加1mg/LZ

12、T和0.8mg/LIAA的MS培養(yǎng)基。黃櫻桃番茄子葉在卡那霉素選擇培養(yǎng)基中生長明顯受到抑制，出愈率和出芽率顯著下降，而出愈時(shí)間和出芽時(shí)間明顯延長，當(dāng)卡那霉素濃度達(dá)到10mg/L時(shí)完全抑制子葉分化。因此，以10mg/L卡那霉素作為外源目的基因轉(zhuǎn)化后的選擇壓。0-500mg/L羧芐青霉素對子葉分化沒有明顯影響，但是卻明顯抑制根生長，而相同濃度的頭孢霉素對根的分化與生長都沒有明顯影響。因此，在抑菌培養(yǎng)階段，芽分化期宜用500mg/L羧芐青霉素

13、，根分化生長期宜用500mg/L頭孢霉素。 子葉侵染、共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化后轉(zhuǎn)移到附加10mg/L卡那霉素和500mg/L羧芐青霉素的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇、抑菌培養(yǎng)時(shí)觀察到，轉(zhuǎn)化愈傷組織與轉(zhuǎn)化不定芽生長緩慢、數(shù)量顯著下降，每個(gè)外植體上最多只分化出1個(gè)不定芽。在未添加乙酰丁香酮和葡萄糖的對照組，轉(zhuǎn)化芽率約6.2％，而在添加了這兩種物質(zhì)的處理組，轉(zhuǎn)化芽率顯著提高，達(dá)到13.1％。將轉(zhuǎn)化芽移到10mg/L卡那霉素和500mg/L頭孢霉素的MS生

14、根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)根分化生長，觀察到根生長緩慢，根數(shù)少。待根長出后即移到無抗生素的培養(yǎng)基中促進(jìn)轉(zhuǎn)化植株生長，最后移栽大田。 對轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行分子檢測與鑒定的結(jié)果顯示，fbpA基因整合入黃櫻桃番茄染色體DNA中，在番茄果實(shí)中表達(dá)的蛋白質(zhì)Ag85A能被結(jié)核病人的血清識(shí)別。 結(jié)論 1.卡介苗D2株編碼分泌型抗原85A的基因fpbA與1173P2株的該基因同源性為100％。 2.黃櫻桃番茄子葉是優(yōu)良的外源基因轉(zhuǎn)化的受體