口服Ag85A DNA疫苗在小鼠腸道局部的表達.pdf

1、自從1997年Jones和Pascual等人分別用PLG(poly-DL-lactide-co-glycolide)微粒和減毒傷寒桿菌(Salmonilla typhimurium)為運載體(vectors)制備口服DNA疫苗以來，已經(jīng)有多篇報道對口服DNA疫苗在預防或治療感染、腫瘤和過敏性疾病中的作用進行了研究，并取得了較好的效果。但口服DNA疫苗在腸黏膜的表達部位及細胞尚不清楚。 腸道黏膜表面是大多數(shù)致病菌進人機體的主要通道

2、。接種黏膜疫苗以激發(fā)免疫效應細胞的活化是抗感染的主要手段之一。腸黏膜免疫系統(tǒng)中參與免疫應答的細胞遍布于腸黏膜內(nèi)，其中M細胞是回腸派氏淋巴結(jié)(Peyer’s patch，PP)表面濾泡相關(guān)上皮(follicle-associated epithelium，F(xiàn)AE)中的一種特殊的上皮細胞，存在于淋巴濾泡上皮之間，與腸上皮細胞緊密排列在一起，形成上皮屏障，并與其“口袋”中的各種淋巴細胞緊密接觸。腸腔中的大部分病原體是由M細胞轉(zhuǎn)運至其下的免疫細

3、胞，從而引起局部的黏膜免疫反應，乃至系統(tǒng)免疫反應。由此可見，M細胞在腸道黏膜免疫反應中起著非常重要的作用。腸上皮細胞形成規(guī)則的微絨毛，而M細胞形成不規(guī)則的微皺褶，因此又稱作微皺褶細胞(Microfold cel1)。M細胞呈圓頂狀，細胞基底部向頂部(腸腔面)深陷，形成一中央腔。M細胞的中央腔很大，含有豐富的淋巴細胞，其頂部及周邊胞質(zhì)很薄，胞質(zhì)中含有大量的吞飲小泡，M細胞的基底膜常常是不連續(xù)的，可允許淋巴細胞自由穿過。M細胞的這些特殊結(jié)構(gòu)

4、及定位大大縮短了含有抗原或病原微生物的吞飲小泡跨越M細胞的距離，有利于抗原快速進人上皮下淋巴組織。目前的研究表明，小腸絨毛上皮M細胞是攝取腸道細菌的重要途徑，還有報道小腸黏膜內(nèi)DC可以攝取抗原物質(zhì)。 抗原85復合體(Ag85)是BCG合成的能夠刺激機體產(chǎn)生細胞免疫和體液免疫的多種成分之一，國外已有研究者將其試用于免疫生物治療。比利時布魯塞爾巴斯德研究所Huygen研究組多年來在對Ag85進行的研究中發(fā)現(xiàn)，接種Ag85蛋白主要引起

5、機體細胞免疫功能增強，他們還觀察到攜帶Ag85基因的的質(zhì)粒DNA疫苗具有：(1)經(jīng)肌肉注射給動物(小鼠)，主要引起Th1樣的應答，產(chǎn)生IL-2、IFN-γ和TNF-α，經(jīng)基因槍注射則主要產(chǎn)生Th2應答和抗體產(chǎn)生水平增加；(2)肌肉注射治療膀胱癌，近80％的病人外周血和脾臟中T淋巴細胞增殖，產(chǎn)生IL-2和IFN-γ的量增加，未見明顯的Th2細胞活化和抗體產(chǎn)生增加；(3)可誘導長壽命的T細胞產(chǎn)生；(4)可降低遲發(fā)型超敏反應的強度。裸DNA疫

6、苗經(jīng)肌肉注射，其目的基因一般在肌細胞內(nèi)表達，誘導機體免疫應答的產(chǎn)生，但經(jīng)口服DNA疫苗在消化道細胞內(nèi)表達定位目前尚無報道。 到目前為止，已有的一些研究表明口服DNA疫苗能誘導全身性細胞和體液免疫應答增強。我們在近期的初步實驗中發(fā)現(xiàn)口服DNA疫苗進入腸道后，在腸黏膜吸收過程中將對IEL產(chǎn)生效應作用，促進黏膜免疫功能增強，有益于衰老和感染的上皮細胞的清除與更新，保持黏膜局部結(jié)構(gòu)和功能的完整性。同時，有關(guān)其是否產(chǎn)生負效應也有待進一步研

7、究。我們推論口服DNA疫苗所產(chǎn)生的全身性免疫效應實際是腸道局部黏膜免疫應答后的一系列反應。 在上述研究的基礎上，本實驗檢測了Ag85A基因的表達產(chǎn)物在腸道局部黏膜上皮細胞、M細胞和DC中的分布，為闡明口服DNA疫苗誘導腸道局部黏膜免疫反應的機制及臨床經(jīng)口接種DNA疫苗提供理論和實驗依據(jù)。 實驗材料和方法： 一、實驗動物：6～8周齡雌性C57BL/6小鼠。 二、主要試劑：自制DNA疫苗pCDNA3.1+/A

8、g85A：Lipofectamine TM2000，chicken anti-Ag85A IgY，HRP-goat-anti-chicken IgY，F(xiàn)ITC-goat-anti-chicken IgY，Purified Armenian Hamster-anti-mouse CD11c，Texas Red conjugated Goat Anti-Armenian Hamster IgG，TRITC conjugated UEA-1，

9、無內(nèi)毒素型超純質(zhì)粒DNA純化試劑盒，BSA，DAB顯色試劑盒。 三、實驗方法：應用基因工程技術(shù)擴增全長Ag85A基因序列，經(jīng)測序和同源性分析后將其亞克隆入真核表達載體pCDNA3.1+，鑒定正確后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5a，擴增抽提無內(nèi)毒素重組質(zhì)粒，進一步用脂質(zhì)體包裹制成口服重組DNA疫苗。將C57BL/6小鼠隨機分為2組，即生理鹽水組和脂質(zhì)體包裹重組質(zhì)粒組。分別將生理鹽水和脂質(zhì)體包裹pCDNA3.1+-Ag85A以灌

10、胃方式投給各組小鼠，共免疫3次，每次間隔14天，末次免疫后14天處死小鼠，取腸，免疫組化、免疫熒光檢測Ag85A在腸黏膜上皮細胞、派氏淋巴結(jié)、腸道局部M細胞及樹突狀細胞的表達情況。 結(jié)果： Ag85A重組DNA疫苗在小鼠腸道局部黏膜上皮細胞、M細胞及派氏淋巴結(jié)樹突狀細胞均有表達。Ag85A在靠近小鼠小腸黏膜固有層的上皮細胞中表達的強度比靠近腸腔側(cè)的上皮細胞表達的強度高，Ag85A在小鼠小腸黏膜M細胞中表達強度非常高。

11、 討論 腸道是接觸抗原物質(zhì)最多的器官，腸道相關(guān)淋巴組織主要包括派氏淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)，然而，腸道內(nèi)發(fā)揮免疫效應的效應細胞并不僅限于此，而是遍布于腸黏膜內(nèi)。M細胞是攝取腸道內(nèi)抗原物質(zhì)的主要細胞，分布于小腸派氏淋巴結(jié)和絨毛上皮。目前的研究表明，小腸絨毛上皮M細胞是攝取腸道細菌的重要途徑，還有報道小腸黏膜內(nèi)DC可以攝取抗原物質(zhì)。實驗表明，M細胞還可以攝取質(zhì)脂體包裹的DNA疫苗，而在小腸黏膜內(nèi)DC中未見到DNA疫苗的表達。

12、 DC是專職抗原提呈細胞，其主要功能是攝取、加工處理和提呈抗原。DC包括成熟和未成熟兩種形式，未成熟的DC主要分布在非淋巴器官和血液中，發(fā)揮哨兵作用。當病原體進入時，未成熟的DC能夠攝取并將其提呈給吞噬細胞。未成熟DC攝取、加工處理抗原能力強，而提呈抗原激發(fā)免疫應答能力弱，成熟DC攝取、加工處理抗原能力弱，而提呈抗原、啟動免疫應答能力強。我們在實驗中未見到小腸黏膜內(nèi)DC表達DNA疫苗編碼的蛋白，而在派氏淋巴結(jié)內(nèi)部分DC中觀察到了DNA疫