GBEE對(duì)獲得性S180MDR細(xì)胞株逆轉(zhuǎn)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　模擬臨床PFC（順鉑+氟尿嘧啶+環(huán)磷酰胺）聯(lián)合化療給藥方案，通過體內(nèi)劑量遞增法誘導(dǎo)S180腹水瘤小鼠，獲得S180腫瘤多藥耐藥(Multi-drug resistance，MDR)細(xì)胞株并研究銀杏外種皮提取物(Ginkgo biloba exocarp extracts，GBEE)對(duì)該細(xì)胞株體內(nèi)外的逆轉(zhuǎn)耐藥作用及其機(jī)制。
　　方法：
　　按臨床PFC化療方案，采用體內(nèi)劑量遞增法誘導(dǎo)S180腹水瘤小鼠，建立獲

2、得性S180MDR模型，采用MTT法、流式細(xì)胞術(shù)動(dòng)態(tài)測(cè)定低、中、高劑量所誘導(dǎo)細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥倍數(shù)、細(xì)胞內(nèi)阿霉素(Adriamycin，ADR)積累量及細(xì)胞膜P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)功能活性以監(jiān)測(cè)所誘導(dǎo)細(xì)胞的耐藥強(qiáng)度;采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)法測(cè)定不同劑量所誘導(dǎo)細(xì)胞MDR-1mRNA、多藥耐藥相關(guān)蛋白-1(multidrugresistance-associated protein1，MRP

3、-1)mRNA的表達(dá)量。取高劑量誘導(dǎo)的S180MDR細(xì)胞研究GBEE的體內(nèi)外逆轉(zhuǎn)耐藥作用。體外實(shí)驗(yàn):采用MTT法測(cè)定GBEE對(duì)S180MDR細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)指數(shù)，采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定GBEE對(duì)S180MDR細(xì)胞內(nèi)ADR積累量、P-gp功能活性的影響;體內(nèi)實(shí)驗(yàn):建立ICR小鼠S180MDR細(xì)胞腹水瘤和實(shí)體瘤模型，將小鼠隨機(jī)分為14組，每組10只，即空白組，模型組，親本細(xì)胞順鉑(cis-dichlorodiamineplatinum，DDP)3mg

4、/kg、 ADR3mg/kg單獨(dú)用藥組，耐藥細(xì)胞DDP3mg/kg、ADR3mg/kg、GBEE50、25、12.5mg/kg、維拉帕米（Verapamil，VER）15mg/kg單獨(dú)用藥組，GBEE50、25、12.5mg/kg+DDP3mg/kg聯(lián)合用藥組以及VER15mg/kg+DDP3mg/kg聯(lián)合用藥組，藥物干預(yù)1周。監(jiān)測(cè)腹水瘤小鼠的存活時(shí)間、計(jì)算實(shí)體瘤小鼠的腫瘤抑制率;采用RT-qPCR法檢測(cè)腹水瘤模型各組小鼠腫瘤細(xì)胞MDR

5、-1mRNA、MRP-1 mRNA的表達(dá)量;采用雙抗夾心ELISA法測(cè)定實(shí)體瘤模型小鼠血清白介素3(Interleukin3，IL-3)、白介素18(Interleukin18，IL-18)及γ-干擾素（Interferon-γ，IFN-γ）的濃度。
　　結(jié)果：
　　建模實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與親本細(xì)胞比較，低、中、高劑量所誘導(dǎo)的S180細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥倍數(shù)隨誘導(dǎo)劑量的增高而逐漸增大，細(xì)胞內(nèi)ADR積累量隨之逐漸減少，細(xì)胞P-gp

6、功能活性隨之逐漸增強(qiáng);所誘導(dǎo)S180細(xì)胞不僅對(duì)DDP、氟尿嘧啶(Fluorouracil，F(xiàn)U)產(chǎn)生了較強(qiáng)的耐藥性，且對(duì)未接觸過的、作用機(jī)制不同的ADR也具有一定程度的交叉耐藥性。所誘導(dǎo)S180細(xì)胞MDR-1mRNA、MRP-1mRNA的表達(dá)量與誘導(dǎo)劑量呈正相關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:GBEE30、15、7.5μg/mL與S180MDR細(xì)胞體外培養(yǎng)后對(duì)DDP的逆轉(zhuǎn)指數(shù)分別為8.48、11.34、9.88; GBEE各劑量能顯著增加S180M

7、DR細(xì)胞內(nèi)ADR蓄積量并抑制P-gp功能活性。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:GBEE50、25、12.5mg/kg灌胃給藥能顯著提升DDP的抗腫瘤作用，延長(zhǎng)S180MDR腹水瘤小鼠存活時(shí)間并抑制小鼠S180MDR實(shí)體瘤生長(zhǎng)，其中GBEE25mg/kg聯(lián)合DDP用藥組對(duì)腹水瘤小鼠的生命延長(zhǎng)率達(dá)37.41％，對(duì)小鼠實(shí)體瘤抑制率達(dá)65.43％（P＜0.01或P＜0.001）;GBEE各劑量能顯著抑制小鼠S180MDR腹水瘤細(xì)胞MDR-1mRNA、MRP-

8、1mRNA的表達(dá)，且能明顯提升S180MDR荷瘤小鼠血清IL-3、IL-18及IFN-γ等細(xì)胞因子的水平(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　采用PFC方案按劑量遞增法體內(nèi)誘導(dǎo)S180腹水瘤小鼠獲得的MDR細(xì)胞模型，其耐藥強(qiáng)度在一定的劑量范圍內(nèi)與誘導(dǎo)劑量呈現(xiàn)正相關(guān)性。GBEE體內(nèi)外給藥對(duì)S180MDR細(xì)胞均具有較明顯的逆轉(zhuǎn)作用，其機(jī)制可能與抑制耐藥腫瘤細(xì)胞MDR-1mRNA、MRP-1mRNA的表達(dá)，減少耐藥蛋白合成，并抑制P