重組Lac Z酵母細胞構(gòu)建及對化學(xué)誘變原的高通量篩選研究.pdf

1、基因毒性(Genotoxic)是指能直接或間接損傷細胞DNA的性質(zhì)。誘變原即具有基因毒性作用的化合物，它能夠改變機體細胞遺傳物質(zhì)而誘發(fā)突變。當今，化學(xué)誘變原已成為危害環(huán)境和人類健康的一大類因素，防止這類化學(xué)污染物對環(huán)境污染成為人類預(yù)防癌癥的重要手段之一。
　　目前，人們已經(jīng)提出多種對致突變化學(xué)誘變原毒性評價的試驗方法，如Ames試驗、微核和染色體試驗等。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，一些常規(guī)的評價檢測方法的缺點逐漸突顯出來:敏感度低，耗時較

2、長，操作繁瑣以及成本過高等方面成為了影響對化學(xué)誘變原毒性評價的因素。本課題利用生物傳感器技術(shù)，與其中的微生物傳感器技術(shù)相結(jié)合，用重組的酵母細胞作為宿主細胞，用Lac Z作用為報告基因，利用經(jīng)化學(xué)誘變原作用后表達產(chǎn)物可催化底物顯色這一特性，特性作為信號轉(zhuǎn)換的標識，評價致突變化學(xué)物的毒性作用強度。
　　化學(xué)誘變物主要分為兩類:直接化學(xué)誘變物和間接化學(xué)誘變物，前者對DNA具有直接損傷作用，后者自身對DNA無損傷作用，但其進入機體內(nèi)可經(jīng)某

3、些反應(yīng)轉(zhuǎn)化為具有基因毒性作用的物質(zhì)。本課題利用構(gòu)建重組酵母細胞分別對直接和間接化學(xué)誘變物進行高通量篩選研究。
　　1.重組酵母細胞W303-1A/RNR3-LacZ的構(gòu)建及對直接誘變物的篩選
　　目的:建立由RNR3調(diào)控重組Lac Z基因酵母細胞以篩選直接化學(xué)誘變物。方法:利用PCR方法從酵母基因組中擴增RNR3啟動子，將其插入到pMP206/ERE酵母報告載體，構(gòu)建成RNR3調(diào)控的Lac Z酵母報告載體，將該載體轉(zhuǎn)入W30

4、3-1A酵母細胞，構(gòu)建成RNR3調(diào)控的重組Lac Z基因酵母細胞。用數(shù)種化學(xué)誘變原作用于該重組基因酵母細胞，觀察其對RNR3的誘導(dǎo)表達，用Excel軟件進行分析。結(jié)果:放線菌素D、絲裂霉素C、阿非迪霉素和溴乙錠不能誘導(dǎo)RNR3的表達，而甲磺酸甲脂、瘤可寧、順鉑、4-硝基-N-氧化喹啉、博來霉素、福來霉素、5-氟尿嘧啶、喜樹堿和羥基脲誘變原與RNR3表達有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。結(jié)論:該重組酵母可用于對多種化學(xué)誘變原的快速篩選。
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5、.重組酵母細胞W303-1A/RN R3-LacZ/GP DV5-CYP1A1的構(gòu)建及對間接誘變物的篩選
　　目的:建立由RNP3調(diào)控重組Lac Z基因及可表達CYP1A1基因的重組酵母細胞以篩選間接化學(xué)誘變物。方法:利用PCR方法從GV142質(zhì)粒上擴增CYP1A1基因，將其插入到pGPDV5酵母表達載體上，構(gòu)建成pGPDV5-CYP1A1酵母表達載體，將該載體轉(zhuǎn)入所建立的W303-1A/RNR3-Lac Z重組酵母細胞，構(gòu)建成可

6、表達CYP1A1及受RNR3調(diào)控的LacZ基因酵母細胞。用Promega公司的試劑盒檢測CYP1A1表達，并用間接誘變原2-氨基芴作用于該重組基因酵母細胞，觀察其對RNR3的誘導(dǎo)表達，用Excel軟件進行分析。結(jié)果:DNA測序表明pGPDV5-CYP1A1酵母表達載體構(gòu)建成功，并經(jīng)PCR鑒定已經(jīng)成功重組于酵母細胞，但經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)CYP1A1活性較低，細胞經(jīng)2-氨基芴作用后，與Lac Z表達無明顯時間劑量效應(yīng)。結(jié)論:CYP1A1表達量不足，