新型重組免疫抑制融合毒素蛋白B7-PE40KDEL的分子構(gòu)建、高通量篩選及結(jié)構(gòu)特性預(yù)測.pdf

1、為了研創(chuàng)B7-PE40KDEL新型重組外毒素整合蛋白,同時也為今后更深入地探討B(tài)7-2和B7-1分子在調(diào)控T細(xì)胞增殖、分化及相關(guān)信號傳導(dǎo)過程中的作用,該研究首先通過PCR克隆獲得了含編碼人B7-2和B7-1分子胞外區(qū)的cDNA.我們采用重疊延伸PCR（SOE-PCR）基因融合技術(shù),通過引物設(shè)計并將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白滯留序列KDEL引入PE40的C-末端,由此構(gòu)建成功了含編碼B7-1-PE40KDEL和B7-2-PE40KDEL的全新型融合蛋白基

2、因,長度分別為179bp和1842bp,它們各自包括了B7-1和B7-2的胞外區(qū)以及PE40的跨膜和細(xì)胞毒功能區(qū).為獲得全新型B7-2-PE40KDEL融合蛋白的高效表達(dá)載體,該研究參考外源基因高效表達(dá)的數(shù)學(xué)模型,采用了高通量篩選策略,將所設(shè)計構(gòu)建的并經(jīng)優(yōu)化密碼子和二級結(jié)構(gòu)的B7-2-PE40KDEL融合毒素基因分別定向插入到pBV220、pTYB4、pGEX-4T-2和pRSETA等二十余種表達(dá)載體中,篩選鑒定正確的重組表達(dá)質(zhì)粒后并轉(zhuǎn)

3、化相匹配的最佳菌株如BL21（DE3）、BL21（DE3）-CodonPlus-RIL中,根據(jù)載體不同類型分別進(jìn)行溫控或化學(xué)等誘導(dǎo)表達(dá).由于該研究構(gòu)建的pRSETA-B7-2-PE40KDEL表達(dá)載體所建達(dá)的目的蛋白N端融合有6個組氨酸殘基標(biāo)記,這十分利于通過Ni-NTA金屬鏊和層析來進(jìn)行表達(dá)產(chǎn)物純化.因此對所表達(dá)目的蛋白的可溶性組分建立了金屬螯合層析柱-Q陰離子交換層柱-SephadexG-75凝膠過濾層析三步純化法,可獲得電泳純的重