Aurora B小分子抑制劑的高通量篩選及化合物IFVR001抗腫瘤作用初探.pdf

1、蛋白質的非正常磷酸化是人類腫瘤等病發(fā)生的重要原因。以蛋白激酶作為藥物靶點，尋找與之相互作用的小分子化合物，并將其中具有激酶活性抑制劑性質的小分子化合物用于新藥研發(fā)，是當今蛋白激酶研究領域的一個重要方向。本研究中，我們以參與染色體分離和胞質分裂且又在多種腫瘤組織中過量表達的AuroraB激酶為靶標，對其小分子抑制劑進行了高通量篩選研究。 我們首先建立了AuroraB體外活性蛋白的高效原核表達體系。通過比較不同融合蛋白的表達效率和純

2、化效果，依據(jù)融合片段小，表達效率高，純化效果佳，且具有體外激酶活性等選擇標準，確定將His6-AuroraB原核表達系統(tǒng)大規(guī)模表達目標蛋白。利用親和純化蛋白方法從發(fā)酵的30升菌液中總共獲得了1000mg具有體外磷酸化活性的AuroraB激酶蛋白。在此基礎上，我們建立了基于同位素標記的液體閃爍計數(shù)蛋白激酶活性測試方法的AuroraB激酶抑制劑的高通量篩選模型。在此模型中，我們以MBP (Myelin Basic Protein) 作為激酶

3、反應的底物。根據(jù)AuroraB的酶學動力學特征，確定了適宜于高通量篩選的底物濃度(ATP25uM，MBP20uM)和線性反應時間。在明了化合物溶劑DMSO對于整個模型的運行無顯著影響后，應用已知蛋白激酶抑制劑星孢菌素(Staurosporine)進行測試，實驗結果證明，我們構建的篩選模型完全符合高通量篩選的要求。 采用這個高通量篩選模型，我們對國家新藥篩選中心庫藏的70，000個小分子化合物進行了高通量篩選。在第一輪篩選中，我們

4、在40uM的化合物濃度下，以90％的酶活性抑制率為陽性化合物閾值，篩選到了882個一級陽性化合物。然后在4uM化合物濃度，以70％的酶活性抑制率為陽性化合物閾值，從一級陽性化合物中篩選出76個二級陽性化合物。經(jīng)IC<,50>測試，其中有8個化合物的IC<,50>位于0～100nM之間，8個化合物的IC<,50>位于100～500nM之間，12個化合物的IC<,50>位于500～1000nM之間，其余48個化合物的IC<,50>位于100

5、0～10000nM之間。 我們隨后考察了其中一個陽性化合物IFVR001的抑制腫瘤效果，結果顯示，在細胞水平，IFVR001能夠顯著的抑制多種腫瘤細胞系的生長。其中，對于人類肝癌細胞系HepG2生長的抑制效果最為強烈，其IC<,50>為0.82uM。對IFVR001在動物水平抑制腫瘤效果的檢測發(fā)現(xiàn)，該化合物能夠顯著的抑制小鼠肝癌H22的瘤體生長，其抑制效果在相同劑量水平下優(yōu)于已運用于臨床腫瘤治療的化療藥物5氟尿嘧啶。IFVR00

6、1與已報道的Aurom Kmases抑制劑相比較，它具有更強的體外激酶活性抑制效果。 “重大新藥創(chuàng)制”是我國“十一五”科技發(fā)展中長期規(guī)劃中的重大專項研究計劃之一。其中“從基因到藥物”的新藥創(chuàng)制路線被列為該計劃的首選策略。本論文的研究工作雖然尚未取得重大的突破性進展，但我們在國家需要我們去開展的研究方向上，進行了有益的嘗試，并取得了一些初步的經(jīng)驗和若干有價值的新藥小分子先導化合物。我們還將繼續(xù)努力，在總結經(jīng)驗的基礎上爭取作出更好的

7、成績。 甘氨酸酰基轉移酶(GLYAT)是與哺乳動物內源和外源羧酸及其異生物的排泄以及脫毒密切相關的一個生化代謝酶家族。在代謝過程中，該家族酶類作為一個重要催化因子催化?；鶊F從輔酶A硫代酸脂轉移到甘氨酸的氨基的轉移過程。該家族酶類的異常與哺乳類動物的有機酸血癥及其相關病理進程有密切聯(lián)系。 迄今為止，甘氨酸?；D移酶 (GLYAT) 編碼基因的研究資料極為匱乏。我們在這里報道了一個新的甘氨酸?；D移酶(GLYAT)編碼基因

8、的分子克隆與初步功能研究。該基因被命名為GLYATL1。其eDNA全長1546bp，開放閱讀框(ORF)編碼一個全長302個氨基酸的多肽。GLYATL1基因由7個外顯子和6個內含子構成，定位在染色體11q12.1區(qū)段，與同家族另外兩個成員毗鄰。組織表達譜分析表明，GLYATL1在肝臟、腎、胰腺、睪丸、卵巢、胃有存在表達，其中，在肝臟中表達強度最高，在腎臟表達強度次之，在卵巢，睪丸，胰腺，胃中的表達強度最弱。在cos-7細胞中的亞細胞定位