高通量篩選吸煙人群中肺癌相關(guān)蛋白的研究.pdf

1、背景：肺癌是目前發(fā)達(dá)國(guó)家乃至全世界危害最為嚴(yán)重的惡性腫瘤之一。在我國(guó)，肺癌患者每年以26％的速度增長(zhǎng)，每年死亡人數(shù)高達(dá)60萬(wàn)之多。目前一致公認(rèn)，肺癌與吸煙的關(guān)系最為密切。我國(guó)現(xiàn)擁有全世界1/3的煙民，80％的男性肺癌和19.3％的女性肺癌都?xì)w因于吸煙，所以降低肺癌的發(fā)病率和死亡率已成為迫切需要解決的問(wèn)題。而能否早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷肺癌成為提高肺癌患者生存率的關(guān)鍵問(wèn)題。近年來(lái)已發(fā)現(xiàn)多種腫瘤標(biāo)志物可用于肺癌的早期診斷，但是專門(mén)針對(duì)于吸煙人群的

2、肺癌腫瘤標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)卻很少。本實(shí)驗(yàn)致力于應(yīng)用蛋白芯片篩選吸煙人群中的肺癌特異性噬菌體克隆，為將來(lái)構(gòu)建診斷芯片從而篩選相關(guān)腫瘤標(biāo)志物奠定基礎(chǔ)。
　　方法：用RNeasy Mini Kit提取吸煙型肺癌組織的總 RNA，分離純化 mRNA，逆轉(zhuǎn)錄合成雙鏈 cDNA，經(jīng)末端修飾、定向 EcoRI/HindIII接頭連接、接頭消化，使其兩端分別帶有 EcoRI和HindIII粘性末端。用Mini Column分離 cDNA片段，收集250

3、 bp以上的雙鏈 cDNA，與T7Select10-3載體連接，體外包裝后，得到吸煙型肺癌組織 T7噬菌體展示 cDNA文庫(kù)。然后將構(gòu)建的噬菌體文庫(kù)進(jìn)行生物淘洗，并用吸煙型肺癌患者血清、非吸煙型正常人血清和吸煙型正常人血清分別對(duì)淘洗后的文庫(kù)進(jìn)行大規(guī)模的篩選，對(duì)所得數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理，并分別對(duì)吸煙肺癌組和非吸煙正常組、吸煙正常組和非吸煙正常組做 t檢驗(yàn)，以P<0.01為差異極顯著，再結(jié)合線性回歸分析，在吸煙肺癌組和吸煙正常組中都高表達(dá)，而在非

4、吸煙正常組中低表達(dá)的噬菌體克隆即為所需的吸煙人群中肺癌相關(guān)克隆。
　　結(jié)果：構(gòu)建的吸煙型肺癌組織 T7噬菌體 cDNA文庫(kù)，經(jīng)測(cè)定，原庫(kù)庫(kù)容為1.35×106 pfu，擴(kuò)增后文庫(kù)滴度為4.4×1010 pfu/ml。PCR鑒定從原始文庫(kù)中隨機(jī)挑取的100個(gè)噬菌斑，重組率為97％，重組體中91％的插入片段長(zhǎng)度>250 bp。經(jīng)所建文庫(kù)與蛋白芯片結(jié)合篩選噬菌體克隆，對(duì)吸煙肺癌組和非吸煙正常組進(jìn)行分析，篩選出158個(gè)在吸煙肺癌組中高表達(dá)