miRNA-625結(jié)合位點多態(tài)性對靶基因AKT2調(diào)控的影響.pdf

1、目的：
　　本實驗構(gòu)建AKT2基因3’端非翻譯區(qū)(3’untranslated regions,3’-UTR)熒光素酶報告基因重組質(zhì)粒，在培養(yǎng)的體外細胞中驗證miRNA-625與AKT2基因的靶向調(diào)控關系，同時構(gòu)建 miRNA-625靶序列中的單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism,SNP) rs2304186突變型熒光素酶報告基因重組質(zhì)粒，驗證SNP rs2304186在miRNA-625靶

2、序列調(diào)控中的作用。
　　方法：
　　通過生物信息學軟件TargetSan預測AKT2是miRNA-625的靶基因。PCR擴增AKT2基因3’-UTR，構(gòu)建AKT23’-UTR rs2304186野生型熒光素酶報告基因載體（ pMIR-AKT2-WT）、 miRNA-625靶位點全突變型質(zhì)粒（pMIR-AKT2-MUT1）及rs2304186突變型質(zhì)粒（pMIR-AKT2-MUT2）,通過Lipofectamine2000將重

3、組質(zhì)粒與 miRNA-625 mimics或 miRNA NC共轉(zhuǎn)染16HBE細胞株、HEK-293T細胞株及 A549細胞株，每個轉(zhuǎn)染組同時加入pRL-SV40作為矯正，雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測螢火蟲(Firefly)熒光素酶和海腎(Renilla)熒光素酶活性。
　　結(jié)果：
　　構(gòu)建的重組熒光素酶報告載體經(jīng)PCR、雙酶切及測序鑒定正確。雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)結(jié)果顯示在三種細胞株中pMIR-AKT2-WT+miR

4、NA-625 mimics組相對熒光素酶活性比pMIR-AKT2-MUT2+miRNA-625 mimics均明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），pMIR-AKT2-MUT2+miRNA-625 mimics比pMIR-AKT2-MUT1+miRNA-625 mimics組明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　miRNA-625對野生型AKT23’-UTR熒光素酶報告基因載體熒光素酶活性有