銀杏葉提取物（金納多）對小鼠急性實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的療效及作用機(jī)制的研究.pdf

1、炎癥性腸病(inflammatory bowel diseases，IBD)是一種自發(fā)的非特異性腸道炎癥性疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)和克羅恩病(Crohn'sdisease，CD)。近年來IBD的患病人數(shù)呈明顯上升趨勢，主要是UC患者劇增。UC可累及直腸、部分結(jié)腸甚至全結(jié)腸，病變?yōu)檫B續(xù)性;CD主要累及回腸和結(jié)腸，可累及整個消化道，病變?yōu)殚g斷性。UC病變主要累及粘膜層和粘膜下層，而CD可累及腸壁全

2、層。CD臨床上可見肉芽腫、腸腔狹窄和瘺管形成，但UC少見。目前認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制主要是遺傳因素、環(huán)境因素，免疫調(diào)節(jié)異常、腸道微生物及持續(xù)的腸道感染等多種因素共同作用的結(jié)果。
　　UC發(fā)病機(jī)制的不明確限制了其治療方面的發(fā)展。故尋找治療新策略及新藥物成為當(dāng)今UC研究領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)。銀杏葉提取物(ginkgo biloba extract，EGB)是從銀杏的葉中分離純化的提取物，其主要活性成分為黃酮糖苷和萜內(nèi)酯。有研究發(fā)現(xiàn)銀杏葉提取物可誘導(dǎo)

3、急性實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的緩解，但關(guān)于其對急性實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的作用機(jī)制目前研究甚少。
　　目的：
　　用3％DSS誘導(dǎo)小鼠急性實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的動物模型;不同劑量銀杏葉提取物(金納多100mg/kg.d、200mg/kg.d、300mg/kg.d)予小鼠灌胃，觀察其對小鼠急性實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的療效及療效-劑量相關(guān)性;探討金納多對小鼠急性實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的作用機(jī)制，同時比較金納多與柳氮磺胺吡啶(SASP)對小鼠急性實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的療效。
　　方

4、法：
　　1、40只雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為5組(n=8):正常組;造模組(3％DSS);低劑量金納多治療組(3％DSS+金納多100mg/kg.d);中劑量金納多治療組(3％DSS+金納多200mg/kg.d);高劑量金納多治療組(3％的DSS+金納多300mg/kg.d)，實(shí)驗(yàn)時間為7天。觀察并記錄每日小鼠飲食、活動、大便性狀、大便潛血情況和體重等一般情況。實(shí)驗(yàn)第8天，將小鼠處死，取距離肛門2cm的腸管約0.5-1cm，

5、用10％中性福爾馬林固定。通過比較各組疾病活動指數(shù)(DAI)、體重變化、腸管長度、組織學(xué)變化和組織學(xué)損傷評分，評價DSS誘導(dǎo)急性實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的動物模型是否成功;金納多對急性實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的療效，并評價金納多的療效在100mg/kg.d-300mg/kg.d范圍內(nèi)與劑量之間的關(guān)系。
　　2、40只雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為5組(n=8):正常組;造模組（3％的DSS）;單純金納多組（金納多300mg/kg.d）;金納多治療組(3％

6、的DSS+金納多300mg/kg.d);SASP治療組(3％DSS+SASP100mg/kg.d)。同實(shí)驗(yàn)第一部分，觀察實(shí)驗(yàn)期間各組小鼠的一般情況。于實(shí)驗(yàn)期第8天，將小鼠處死，取腸管分別用于固定(HE染色、免疫組化)、Real-time PCR和Western。比較各組DAI評分、體重變化、腸管長度、組織學(xué)變化和組織學(xué)損傷評分。應(yīng)用Real-time PCR和免疫組化檢測IL-6、IL-17、IL-23等細(xì)胞因子的表達(dá)，應(yīng)用Real-t

7、ime PCR方法檢測信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子STAT3 mRNA的表達(dá)。用Western方法檢測STAT3和p-STAT3的表達(dá)，進(jìn)而探討金納多對小鼠急性實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的作用機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1、正常組小鼠一周內(nèi)，正常進(jìn)食飲水，大便正常;造模組小鼠于第4天飲食減少，體重明顯減輕，出現(xiàn)糊樣便，便潛血陽性，于第5天，小鼠出現(xiàn)肉眼血便;各治療組一般狀況明顯好于造模組。解剖后各組小鼠腸管的長度比較，正常組＞高劑量治療組＞中劑量治療組＞低劑

8、量治療組＞造模組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。正常組小鼠體重在實(shí)驗(yàn)期間呈逐漸上升的趨勢，與造模組比較，從實(shí)驗(yàn)第2天開始，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);低劑量治療組小鼠體重與造模組比較，從第6天開始，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);中劑量治療組與高劑量治療組小鼠體重與造模組比較，從實(shí)驗(yàn)第4天，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);金納多各治療組小鼠體重比較，低劑量治療組＜中劑量治療組＜高劑量治療組，于實(shí)驗(yàn)第4天開始，差異有統(tǒng)計學(xué)意

9、義P＜0.05）。高劑量治療組，中劑量治療組和低劑量治療組DAI評分呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，但明顯低于造模組，于實(shí)驗(yàn)第三天開始，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。正常組小鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)完整，未見粘膜糜爛、潰瘍形成;造模組小鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)紊亂，腺體破壞，部分隱窩破壞和隱窩變形，嚴(yán)重者可見潰瘍形成，炎癥細(xì)胞大量浸潤，以中性粒細(xì)胞為主，伴有少量單核、淋巴細(xì)胞，炎癥主要累及粘膜層和粘膜下層;治療組小鼠腸組織結(jié)構(gòu)基本完整，部分腺體破壞，炎癥細(xì)胞浸潤較

10、造模組明顯減輕。各組小鼠組織學(xué)損傷評分比較，正常組＜高劑量治療組＜中劑量治療組＜低劑量治療組＜造模組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2、正常組和單純金納多組的小鼠一周內(nèi)，進(jìn)食正常，大便為成型黃便;造模組小鼠飲食減少，體重明顯減輕，部分小鼠出現(xiàn)糊樣便和水樣便，便潛血陽性，個別小鼠出現(xiàn)肉眼血便;金納多治療組和SASP治療組小鼠活動仍有減少，體重減輕，部分小鼠可見便潛血陽性和糊樣便，與模型組相比，一般狀況均好于模型組。各組小鼠

11、腸管長度比較，模型組＜金納多治療組＜SASP治療組＜正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。正常組小鼠腸管長度與單純金納多組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。正常組和單純金納多組小鼠體重在實(shí)驗(yàn)期間呈逐漸上升的趨勢，兩組小鼠體重比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);造模組小鼠體重與正常組比較，從實(shí)驗(yàn)第二日，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);單純金納多組與造模組比較，從實(shí)驗(yàn)第一天，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。金納多治療組、S

12、ASP治療組體重與造模組比較，分別從實(shí)驗(yàn)第二天和第一天，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。SASP治療組小鼠體重與金納多治療組比較，實(shí)驗(yàn)第4、5天，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。各組小鼠腸管DAI評分和組織學(xué)損傷評分比較，模型組＞金納多治療組＞SASP治療組＞正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。正常組小鼠腸管長度和組織學(xué)損傷評分與單純金納多組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。正常組和單純金納多組小鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)完整，未見

13、粘膜糜爛、潰瘍形成;造模組小鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)紊亂，腺體破壞甚至缺失，部分隱窩結(jié)構(gòu)破壞甚至變形，嚴(yán)重者可見潰瘍形成，大量炎癥細(xì)胞浸潤，其中以中性粒細(xì)胞為主，伴有少量單核、淋巴細(xì)胞，炎癥主要累及粘膜層和粘膜下層;金納多治療組和SASP治療組小鼠腸組織部分腺體破壞，炎癥細(xì)胞浸潤較造模組明顯減輕。
　　造模組、金納多治療組和SASP治療組與正常組比較，IL-6mRNA、STAT3mRNA、IL-17mRNA和IL-23mRNA的表達(dá)增強(qiáng)，差

14、異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);單純金納多組與正常組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);金納多治療組和SASP治療組與造模組比較，IL-6mRNA、STAT3mRNA、IL-17mRNA和IL-23mRNA的表達(dá)均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);金納多治療組與SASP治療組比較，IL-6mRNA、STAT3mRNA、IL-17mRNA和IL-23mRNA的表達(dá)略增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。Western檢測方法檢

15、測結(jié)果:造模組p-STAT3的表達(dá)最高，依次是金納多治療組、SASP治療組、正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);單純金納多組p-STAT3的表達(dá)與正常組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。Western方法檢測STAT3蛋白的表達(dá)，各組之間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。應(yīng)用免疫組化方法檢測IL-6、IL-17和IL-23細(xì)胞因子蛋白的表達(dá)，結(jié)果同用Real-time PCR方法檢測以上細(xì)胞因子mRNA的結(jié)果一致。