南蛇藤提取物調(diào)控HSP27抑制胃癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用及機(jī)制研究.pdf

1、朱耀東南蛇藤提取物調(diào)控H S P 2 7 抑制胃癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用及機(jī)制研究 三南蛇藤提取物調(diào)控H S P 2 7 抑制胃癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用及機(jī)制研究博士研究生：朱耀東導(dǎo) 師：劉延慶教授摘要胃癌是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，是嚴(yán)重危害我國人民健康的重大疾病之一。由于早期癥狀不典型，確診時多處于中晚期，轉(zhuǎn)移率高、預(yù)后差、化療敏感性低，是制約胃癌患者提高生存率的重要因素。目前認(rèn)為上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化( e p i t h e l i a l ．

2、m e s e n c h y m a l t r a n s i t i o n s ，E M T ) 是包括胃癌在內(nèi)的多種來源于上皮細(xì)胞的惡性腫瘤獲得侵襲轉(zhuǎn)移能力的重要生物學(xué)過程，已成為抗腫瘤藥物研究的重要靶點(diǎn)。開發(fā)能夠抑制胃癌E M T 的抗腫瘤新藥，對于防治胃癌的轉(zhuǎn)移，改善患者預(yù)后具有重要的意義。南蛇藤( C e l a s t r u s o r b i c u l a t u s T h u n b ．) 為衛(wèi)矛科南蛇藤屬落

3、葉木質(zhì)藤本植物，是我國重要的藥用植物，其莖、根、葉和果均可入藥，具有祛風(fēng)除濕、通經(jīng)止痛、活血解毒等功效。近年來，南蛇藤莖乙酸乙酯提取物( Co r b i c u l a t u s e t h y la c e t a t ee x t r a c t , C O E ) 的抗腫瘤作用己被廣泛證實(shí)，但以往的研究多集中在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡，抑制腫瘤血管生成、侵襲轉(zhuǎn)移等方面，關(guān)于針對其在腫瘤E M T 方面的研究甚少。課題組前期研究發(fā)

4、現(xiàn)C O E 可以抑制胃癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力，然而C O E 是否具有抑制胃癌E M T 發(fā)生的作用及其確切機(jī)制尚不清楚。本課題主要在前期研究的基礎(chǔ)，利用轉(zhuǎn)錄生長因子1 3 1 ( t r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o r —p 1 ，T G F —p 1 ) 誘導(dǎo)胃癌S G C - 7 9 0 1 細(xì)胞發(fā)生E M T 過程，建立E M T 模型。研究C O E 對T G F ．D 1

5、 誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞E M T 發(fā)生的抑制作用及其可能的分子機(jī)制。建立裸鼠胃癌皮下移植瘤和腹腔轉(zhuǎn)移瘤模型，研究C O E 在體內(nèi)對胃癌生長、轉(zhuǎn)移的影響及分子機(jī)制。通過本課題的研究，進(jìn)一步闡明了C O E 抑制胃癌E M T的作用及相關(guān)分子機(jī)制，為開發(fā)新型抗胃癌藥物提供新的策略和理論依據(jù)。本課題共分為三部分研究內(nèi)容。朱耀東南蛇藤提取物調(diào)控H S P 2 7 抑制胃癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用及機(jī)制研究 三第二部分H S P 2 7 在南蛇藤提取物抑制

6、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和調(diào)控N F ．K B ／S n a i l 信號通路中的作用目的：以H S P 2 7 為研究切入點(diǎn)，探討H S P 2 7 在C O E 抑制T G F ．B l 誘導(dǎo)的S G C ．7 9 0 1 細(xì)胞E M T 發(fā)生中的作用，以及H S P 2 7 在C O E 對腫瘤壞死因子0 【( t U l T I O r n e c r o s i sf a c t o r ．c 【，T N F ．c t ) 誘導(dǎo)的核因子r

7、 d 3 ( n u c l e a r f a c t o r ．r , B ，N F ．r d 3 ) ／S n a i l 信號通路調(diào)節(jié)中的作用。方．{ 去：不同濃度( 5 ，1 0 ，2 0r t g ／m L ) 的C O E 作用于T G F —B 1 ( 1 0 n g ／m L ) 誘導(dǎo)的S G C 一7 9 0 1細(xì)胞2 4h 后，W e s t e r n b l o t 和實(shí)時熒光定量P C R 技術(shù)分別檢測細(xì)胞中

8、H S P 2 7 蛋白及m R N A表達(dá)水平的變化，以探討C O E 對S G C ．7 9 0 1 細(xì)胞H S P 2 7 基因表達(dá)的影響。C O E ( 2 0 斗g ／m L )和蛋白酶體抑制劑M G l 3 2 ( 1 州) 共同作用于T G F ．[ 3 1 誘導(dǎo)的S G C ．7 9 0 1 細(xì)胞2 4 h 后，W e s t e r n b l o t 技術(shù)檢測細(xì)胞中H S P 2 7 蛋白表達(dá)的變化，以明確C O E

9、 降解H S P 2 7 蛋白的可能途徑。構(gòu)建重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體M I G R l ．H S P 2 7 ，將其轉(zhuǎn)染S G C ．7 9 0 1 細(xì)胞，篩選逆轉(zhuǎn)錄病毒細(xì)胞株S G C ．7 9 0 1 ．M I G R l 和S G C ．7 9 0 1 ．M I G R l ．H S P 2 7 ，W e s t e r nb l o t 技術(shù)探討H S P 2 7 是否具有調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞E M T 發(fā)生的作用。C O E ( 2 0

10、“g ／m L ) 作用于T G F —B l ( 1 0n g ／m L ) 誘導(dǎo)的S G C ．7 9 0 1 ．M I G R l 和S G C ．7 9 0 1 ．M I G R l ．H S P 2 7 細(xì)胞2 4 h 后，W e s t e r n b l o t和T r a n s w e l l 小室實(shí)驗(yàn)分別檢測上述兩種細(xì)胞中E M T 相關(guān)蛋白( E ．c a d h e r i n 、N ．c a d h e r i

11、 n 、V i m e n t i n ) 表達(dá)的水平和細(xì)胞侵襲、遷移能力的變化，明確H S P 2 7 在C O E 抑制胃癌E M T中的作用。不同濃度( 5 ，1 0 ，2 0r , g ／m L ) 的C O E 作用于T N F —a ( 1 0 n g ／m L ) 誘導(dǎo)的S G C - 7 9 0 1細(xì)胞2 4 h 后，雙熒光素酶的報告基因檢測技術(shù)檢測C O E 對細(xì)胞N F ．r , B 啟動子活性的影響。不同濃度( 5

12、 ，1 0 ，2 0r t g ／m L ) 的C O E 作用于S G C 一7 9 0 1 細(xì)胞1 2h 后或C O E ( 2 0 斗g ／m L )作用S G C ．7 9 0 1 細(xì)胞1 、3 、6 、1 2h 后，W e s t e r n b l o t 技術(shù)檢測細(xì)胞中N F ．r , B ／S n a i l 信號通路中關(guān)鍵蛋白( N F ．K B p 6 5 、I r , B a 、P ．I r d 3 a 、S n

13、a i l ) 表達(dá)的情況，從而明確C O E 對S G C ．7 9 0 1細(xì)胞中N F - r ．B ／S n a i l 信號通路的影響。C O E ( 2 0 “g ／m L ) 分別作用于T N F —a ( 1 0 n g ／m L )誘導(dǎo)的S G C ．7 9 0 1 ．M I G R l 和S G C ．7 9 0 1 ．M I G R l ．H S P 2 7 細(xì)胞，．通過雙熒光素酶的報告基因檢測技術(shù)及W e s t

14、e r n b l o t 技術(shù)，進(jìn)一步明確H S P 2 7 在C O E 對T N F ．a(chǎn) 誘導(dǎo)的N F ．r ．B ／S n a i l信號通路調(diào)節(jié)中的作用。結(jié)果：不同濃度( 5 ，1 0 ，2 0 ¨g ／m L ) 的C O E 作用于T G F 一8 1 ( 1 0 n g ／m L ) 誘導(dǎo)的S G C 一7 9 0 1細(xì)胞2 4 h 后，呈濃度依賴性的抑制H S P 2 7 蛋白的表達(dá)水平( 尸 0 ．0 5