南蛇藤提取物抑制肝癌血管生成及增強(qiáng)樹突狀細(xì)胞功能的研究.pdf

1、血管過度生成是原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC,以下簡稱肝癌)生長、侵襲和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ),可為腫瘤細(xì)胞提供充足的營養(yǎng)和排出代謝廢物。腫瘤血管生成是一個復(fù)雜的過程,受多種基因、細(xì)胞因子及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的協(xié)同調(diào)控。
　　 血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是目前所知活性最強(qiáng)的促進(jìn)血管生成的細(xì)胞因子,在肝癌細(xì)胞中過量表達(dá),處于血管生成相關(guān)

2、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的核心地位,可作為肝癌治療的靶標(biāo)之一。
　　 VEGF的過量表達(dá)還可影響免疫系統(tǒng)樹突狀細(xì)胞(dendritic cells,DCs)的成熟及功能。DCs是體內(nèi)功能最強(qiáng)大的專職抗原提呈細(xì)胞,具有免疫監(jiān)視作用,可活化初始性T細(xì)胞,并分泌不同的細(xì)胞因子,使輔助性T淋巴細(xì)胞(T helper lymphocytes,Th)向Th1或Th2方向分化,分別激發(fā)細(xì)胞免疫或體液免疫效應(yīng),與肝癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后關(guān)系密切。
　　

3、 中草藥南蛇藤(Celastrus orbiculatus thunb.,衛(wèi)矛科,南蛇藤屬)的應(yīng)用在我國已有幾千年的歷史,主要用于抗風(fēng)濕和其它抗炎治療。本課題組前期研究顯示,南蛇藤莖乙酸乙酯提取物(C.orbiculatus ethyl acetate extracts,COE)具有抗腫瘤的生物學(xué)活性,但其作用機(jī)制還未完全揭示。
　　 本研究首次對COE抗肝癌血管生成的機(jī)制進(jìn)行研究,結(jié)果證實(shí),COE促進(jìn)小鼠肝癌細(xì)胞Hepa1-

4、6的早期凋亡,通過抑制Hepa1—6細(xì)胞中VEGF mRNA的轉(zhuǎn)錄降低VEGF蛋白的表達(dá)。同時,COE抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical veinendothelial cells,HUVECs)形成網(wǎng)絡(luò)樣毛細(xì)血管叢。
　　 分離正常C57BL/6小鼠骨髓CDllc+DCs,以不同濃度(10,20,40,80或160μg/mL)的COE對其成熟過程進(jìn)行干預(yù),研究COE是否影響DCs的成熟和功能。結(jié)果表明COE明

5、顯增加DCs表面共刺激分子、MHC分子及趨化因子的表達(dá)量,促進(jìn)DCs的分化和成熟。同時,COE促進(jìn)DCs分泌Th1類細(xì)胞因子,增強(qiáng)DCs活化T細(xì)胞的功能。
　　 體內(nèi)研究顯示,COE抑制C57BL/6小鼠Hepa1-6細(xì)胞移植瘤的生長,降低血清VEGF濃度,減少移植瘤內(nèi)VEGF的表達(dá)和微血管密度。COE促進(jìn)荷瘤小鼠體內(nèi)DCs的成熟,增加腫瘤特異性CD8+T細(xì)胞的數(shù)目。
　　 綜上,一方面,COE降低肝癌血管生成,抑制移植

6、瘤生長;另一方面,COE促進(jìn)DCs的成熟,增強(qiáng)DCs激活T細(xì)胞的功能,提高機(jī)體的抗腫瘤免疫能力。本研究為南蛇藤莖乙酸乙酯提取物的深入研究提供了一定的理論和科學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù),也為肝癌的治療帶來新的思路。
　　 研究共分為三部分內(nèi)容。
　　 第一部分
　　 南蛇藤提取物抑制肝癌血管生成的體外研究
　　 目的:研究COE對小鼠肝癌細(xì)胞Hepa1-6的增殖、凋亡及VEGF表達(dá)水平的影響,并觀察COE能否抑制原代人臍靜

7、脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelialcells,HUVECs)形成網(wǎng)絡(luò)樣毛細(xì)血管叢,初步探討COE抗腫瘤血管生成的機(jī)制。
　　 方法:MTT法觀察不同濃度(10,20,40,80及160μg/mL)的COE對Hepa1-6細(xì)胞增殖能力的影響。Hepa1-6細(xì)胞經(jīng)不同濃度(10,20,40,80及160μg/mL)的COE處理后,標(biāo)記Annexin V/PI,流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡的細(xì)胞,酶聯(lián)免

8、疫吸附測定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)測定細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGF的濃度,并進(jìn)一步用細(xì)胞免疫組化、Western Blot及半定量RT-PCR的方法檢測Hepa1-6細(xì)胞中VEGF蛋白及mRNA的表達(dá)量。在Matrigel基質(zhì)膠上三維培養(yǎng)HUVECs,加入不同濃度(10,20,40,80及160μg/mL)的COE,光學(xué)顯微鏡觀察COE對HUVECs血管生成擬態(tài)的影響。
　　

9、 結(jié)果:藥物作用48h,10,20,40,80及160μg/mLCOE對Hepa1-6細(xì)胞的增殖抑制率分別為7.51±0.73％,23.39±1.02％,36.64±2.13％,41.16±3.15％及52.47±3.23％,呈明顯的時間劑量依賴性,與對照組5.28±0.69％相比,均顯示顯著差異(P＜O.01)。根據(jù)COE對Hepa1-6細(xì)胞增殖的抑制率,計算COE的半數(shù)抑制濃度(50％ concentration of inhibi

10、tion,IC50)為120.998μg/mL。
　　 不同濃度(10,20,40,80及160μg/mL)COE作用12h后,早期凋亡的細(xì)胞(Annexin V+PI,Q4象限)數(shù)目分別為12.0±2.3％,13.9±1.5％,15.3±2.8％,17.2±3.4％及21.7±5.6％,與陰性對照組5.2±1.7％相比,具有顯著差異(P＜0.05或P＜0.01)。結(jié)果說明COE誘導(dǎo)Hepa1-6細(xì)胞的早期凋亡,并呈劑量依賴性。

11、
　　 對數(shù)生長期Hepa1-6細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中孵育12h,加入不同濃度(10,20,40,80和160μg/mL)的COE作用16h后,用細(xì)胞免疫組化的方法,以抗鼠VEGF多克隆抗體檢測Hepa1-6細(xì)胞中VEGF的表達(dá)量。結(jié)果顯示,與對照組相比,COE的濃度超過40μg/mL時,可明顯抑制Hepa1-6細(xì)胞中VEGF蛋白的表達(dá)量(P＜0.01)。ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中的VEGF表達(dá)水平,結(jié)果顯示COE濃度大于40μ

12、g/mL可明顯抑制VEGF蛋白的表達(dá)(P＜0.01).半定量RT-PCR法進(jìn)一步分析COE對VEGF mRNA的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)COE明顯抑制VEGF mRNA的表達(dá)水平,其抑制作用呈劑量依賴性。綜合分析上述結(jié)果,COE可以抑制小鼠肝癌細(xì)胞Hepa1-6中VEGF的表達(dá)水平,且其機(jī)制為通過抑制VEGF mRNA的轉(zhuǎn)錄進(jìn)而抑制VEGF蛋白的翻譯過程。
　　 HUVECs接種于Matrigel基質(zhì)膠上,不同濃度(10,20,40,80

13、及160μg/mL)COE作用18h。鏡下顯示,10μg/mL COE組,HUVECs網(wǎng)狀毛細(xì)血管管腔數(shù)目(78±12)與陰性對照組(84±17)沒有明顯差異(P＞0.05)。20μg/mL COE組,網(wǎng)狀管腔數(shù)目為43±9,明顯減少(P＜O.01);80μg/mLCOE組,部分HUVECs細(xì)胞能夠形成梭狀或長條狀,但不能形成網(wǎng)狀管腔(P＜0.01);COE濃度為160μg/mL時,幾乎完全抑制HUVECs細(xì)胞形成血管管腔(P＜0.01

14、)。
　　 結(jié)論:南蛇藤提取物可抑制肝癌細(xì)胞增殖,促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡,下調(diào)肝癌細(xì)胞表達(dá)VEGF,抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞形成網(wǎng)絡(luò)樣毛細(xì)血管叢,進(jìn)而抑制肝癌生長和血管生成。
　　 第二部分
　　 南蛇藤提取物促進(jìn)樹突狀細(xì)胞成熟和功能的體外研究
　　 目的:體外觀察COE對樹突狀細(xì)胞(dendritic cells,DCs)的成熟和功能的影響,探討COE發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的機(jī)制。
　　 方法:分離正常C57BL/

15、6小鼠脛骨和股骨的骨髓中的CD11c+DCs,以不同濃度(10,20,40,80及160μg/mL)的COE作用5d后,10 ng/mL的LPS刺激DCs成熟,流式細(xì)胞術(shù)分析DCs表面分子,ELISA檢測DCs培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子的含量?；旌狭馨图?xì)胞反應(yīng)(mixed lymphocyte reaction,MLR)分析COE對DCs活化T淋巴細(xì)胞能力的影響。
　　 結(jié)果:COE(10-160μg/mL)促進(jìn)DCs表面共刺激分子(C

16、D40,CD80和CD86)及MHC分子(H-2Kb和I-Ab)的表達(dá),增加DCs趨化因子受體CCR7的表達(dá)量,增強(qiáng)DCs活化T淋巴細(xì)胞的能力,并呈劑量依賴性。
　　 20μg/mL COE組,DCs分泌IFN-γ的濃度為983.9±25.9 pg/mL,與對照組(745.3±18.5 pg/mL)相比,有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜O.05);40μg/mL COE組,IFN-γ濃度為1060.2±43.8 pg/mL,與對照組相比,有極

17、顯著差異(P＜O.01)。
　　 10μg/mL和20μg/mL COE組,DCs分泌IL-2的濃度分別為176.1±13.9 pg/mL和184.2±13.1 pg/mL,與對照組112.8±16.1 pg/mL相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);40μg/mL COE組,IL-2濃度為208.0±12.3 pg/mL,與對照組相比,有極顯著差異(P＜0.01)。
　　 10,20,40,80,160μg/mL COE組

18、,DCs分泌IL-10的濃度分別為301.0±15.9pg/mL,233.2±24.7pg/mL(P＜O.05),185.7±11.3 pg/mL(P＜0.05),157.6±21.8pg/mL(P＜0.01),145.5±12.2 pg/mL(P＜O.01),與對照組349.7±17.3 pg/mL相比,有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 10,20,40,80,160μg/mL COE組,DCs分泌IL-4的濃度分別為445.6±17.8

19、pg/mL,424.5±15.6 pg/mL(P＜0.05),324.6±25.2 pg/mL(P＜0.05),179.8±17.0pg/mL(P＜0.01),53.2±16.3 pg/mL(P＜0.01),與對照組558.9±11.7 pg/mL相比,有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 經(jīng)COE干預(yù)后,DCs活化T細(xì)胞能力增強(qiáng),與對照組T淋巴細(xì)胞的增值率42.4±5.1％相比,10,20,40,80,160μg/mL COE組T淋巴細(xì)胞的增

20、值率分別為45.0±1.3％(P=0.581),58.3±6.2％(P=0.005),63.6±6.1％(P=0.001),78.1±7.3％(P=0.000),105.0±5.7％(P=0.000)。
　　 結(jié)論:COE能促進(jìn)DCs的成熟;增強(qiáng)DCs對淋巴細(xì)胞的趨化和活化作用;促進(jìn)DCs分泌Th1類細(xì)胞因子(IFN-γ,和IL-2),抑制DCs分泌Th2類細(xì)胞因子(IL-10和IL-4),可使Th細(xì)胞向Th1方向極化,具有明顯

21、的免疫調(diào)節(jié)的效果。
　　 第三部分
　　 南蛇藤提取物抑制肝癌血管生成及增強(qiáng)樹突狀細(xì)胞功能的體內(nèi)研究
　　 目的:研究COE對C57BL/6小鼠Hepa1-6細(xì)胞肝癌移植瘤及血管生成的影響,同時分析COE能否增加成熟樹突狀細(xì)胞的數(shù)目,促進(jìn)荷瘤小鼠的細(xì)胞免疫功能。
　　 方法:將60只C57BL/6小鼠據(jù)體重隨機(jī)分為正常組、模型組(1％DMSO)、陽性對照組(1 mg/kg順鉑)及COE高、中、低劑量(40

22、,20,10mg/kg)組,每組10只。除正常組外,于左前肢腋部皮下接種小鼠肝癌細(xì)胞株Hepa1-6(1×106)0.1 mL/只。接種后2W,連續(xù)給藥28d,末次藥24h后,檢測腫瘤體積及重量,末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的脫氧尿苷三磷酸鹽缺口標(biāo)記法(terminaldeoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling assay,TUNEL)檢測移植瘤組織內(nèi)腫瘤細(xì)胞的凋

23、亡,ELISA檢測血清中VEGF的濃度,免疫組化檢測移植瘤組織內(nèi)微血管密度及VEGF的表達(dá)。流式細(xì)胞術(shù)分別檢測荷瘤小鼠脾臟內(nèi)成熟DCs(CD11b+CD11c+)及CD8+T細(xì)胞的數(shù)目。
　　 結(jié)果:與模型組平均瘤重1.08±0.10 g相比,南蛇藤提取物中、低劑量組平均瘤重分別為0.69±0.10 g和0.83±0.10 g,均能有效抑制腫瘤生長(P＜0.05),南蛇藤提取物高劑量組平均瘤重0.51±0.15 g,明顯抑制腫瘤

24、生長(P＜0.01),抑制作用具有劑量依賴性。
　　 肝癌移植瘤組織切片內(nèi),COE低劑量組平均凋亡細(xì)胞數(shù)為8.52±0.43,與模型組平均凋亡細(xì)胞數(shù)(6.36±0.69)相比,沒有統(tǒng)計學(xué)差異;COE中、高劑量組及陽性對照順鉑組的平均凋亡細(xì)胞數(shù)分別是26.46±3.76,50.41±6.79和54.70±5.31,與模型組相比均有顯著差異(P＜0.01)。
　　 ELISA測得荷瘤小鼠血清VEGF濃度,COE低、中、高劑量

25、組及陽性對照順鉑組分別為245.12±22.99 pg/mL(P＜0.05),72.08±16.97 pg/mL(P＜0.01),45.24±21.36 pg/mL(P＜0.01),70.22±29.59 pg/mL(P＜0.01),與模型組332.02±57.64pg/mL相比,均有統(tǒng)計學(xué)意義。肝癌移植瘤組織切片內(nèi)VEGF的表達(dá)較模型組明顯減少(P＜0.05或P＜0.01)。
　　 抗CD34特異性抗體對腫瘤組織微血管密度分析

26、,COE低、中、高劑量組及順鉑組的MVD分別為14.33±1.69,11.18±1.35,6.76±1.48和6.85±1.14,與DMSO模型對照組的MVD值(16.43±2.53)相比明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。COE中、低劑量組MVD明顯高于順鉑組(P＜0.01),而高劑量組與順鉑組比較,無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 流式細(xì)胞術(shù)顯示COE增加荷瘤小鼠脾內(nèi)成熟DCs(CD11c+CD11b+)及CD8