皂莢提取物對肝癌大鼠新生血管細胞信號傳導(dǎo)的影響及作用機理研究.pdf

1、一、研究目的：
　　本課題通過理論與實驗研究，探討皂莢提取物對原發(fā)性肝癌是否具有明顯的改善和治療作用，同時研究皂莢提取物組、索拉菲尼組、空白組和模型組對大鼠肝癌的療效差別，從而探討皂莢提取物治療原發(fā)性肝癌的機制，為臨床正確合理使用皂莢治療原發(fā)性肝癌提供實驗依據(jù)。
　　二、研究方法：
　　第一部分理論研究
　　1.皂莢及其提取物臨床上對治療原發(fā)性肝癌的效果非常突出，且不良反應(yīng)較少，與肝癌的治療和預(yù)后關(guān)系密切。

2、>　　2.肝癌內(nèi)的微血管密度可以作為一個新的生物學(xué)特征，它反應(yīng)了癌細胞的發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移的程度，可以作為腫瘤轉(zhuǎn)移的預(yù)測因子和指標。
　　第二部分實驗研究
　　1.肝癌模型的建立
　　1.1大鼠腹水瘤的建立
　　將Walker-256細胞株先置于-80℃的冰柜里凍存，待用時將其從凍存管中取出，然后放到水浴當(dāng)中（37℃），待細胞株完全融化后，從凍存管取出。用吸管不停地吹打細胞懸液，然后轉(zhuǎn)移到離心管當(dāng)中（15ml）。緩

3、慢加入8ml PBS緩沖液，并輕輕晃動離心管。然后以1000轉(zhuǎn)/分的速度離心離心管10min，清除上清，用PBS緩沖液清洗2次。隨后用PBS緩沖液4ml重懸細胞，在5只Wistar大鼠的腹腔內(nèi)分別注入1ml的細胞懸液。1個月后大鼠腹部會逐漸膨起，此時形成癌性腹水。
　　1.2種植用腹水瘤的制備
　　在傳代的Wistar大鼠體內(nèi)抽取癌性腹水5ml（基本呈淡紅色洗肉水樣），放于離心機內(nèi)進行離心（以2000轉(zhuǎn)/分的速度離心2min

4、）。然后棄去上層清亮淡色液體，抽取下層粘稠的濃縮腹水1ml，作為備用。
　　1.3肝癌模型
　　首先對大鼠腹腔內(nèi)注射水合氯醛（按40μg/100g體重進行配制）進行麻醉，把大鼠以呈仰臥位固定于鼠板上，用0.5％活力碘消毒腹部，順著腹白線剪開并逐層分離腹部，大鼠的腹腔臟器會逐漸顯現(xiàn)，肝臟在上腹部膨出。把最外層肝葉作為實驗標本，將乘有癌性腹水的注射器以30度的傾斜角度刺入肝臟內(nèi)約0.5cm，輕輕推送癌性腹水約0.05ml。然后拔

5、出注射器針頭，用消毒棉簽按壓在注射點直到不出血為止。將肝臟重納入腹腔后，關(guān)閉腹腔。采用紅霉素軟膏擦拭消毒傷口。共制備50只大鼠肝癌模型，然后進行一周的適應(yīng)性喂養(yǎng)，隨機分為5組。
　　2.實驗分組及處理措施
　　實驗前禁食2小時，先分別給各組大鼠稱量體重，然后根據(jù)人臨床用量（豬牙皂生藥量1.5g.60kg.d-1）、人與大鼠的等效劑量倍數(shù)，增加至6倍作為皂莢提取物低劑量組的實驗用量，按1：2：4，將60只雄性大鼠隨機分為6組，

6、即：皂莢提取物低劑量(0.15g.kg.d-1)組、皂莢提取物中劑量(0.3g.kg.d-1)組、皂莢提取物高劑量(0.6g.kg.d-1)組、索拉非尼組:0.08g/kg/d（索拉非尼成人0.8g/d,按人與大鼠體表面積折算的等效劑量計算，0.8g×7／70=0.08g/kg/d）；空白對照(E)組：0.9%生理鹽水10 ml/kg/d對正常大鼠進行灌胃；模型組：0.9%生理鹽水10 ml/kg/d對肝癌大鼠進行灌胃。每天實行等時（1

7、4：30）等對各組大鼠進行灌胃一次，每周連續(xù)灌胃6次，周日測大鼠體重，然后再根據(jù)體重調(diào)整劑量，各組連續(xù)給藥30天。
　　3.實驗步驟
　　3.1 MVD實驗步驟：解剖實驗大鼠，取出肝臟組織,并以4%的甲醛溶液固定,修剪組織并沖洗后經(jīng)梯度酒精脫水，常規(guī)石蠟包埋切片(片厚6μm)、以鼠抗-CD34（1:50）為第一抗體，EnVision(rat)為第二抗體（均購于Abcam公司，貨號：Ab185732）進行免疫組織化學(xué)染色。根據(jù)

8、Weidner校正方法，先用低倍鏡（×10）在每一個標本先下選取熱點（5個微血管數(shù)最多的區(qū)域），然后在每一個熱點中計算一個高倍鏡（×40）下的微血管數(shù)目，取其平均值為MVD值[3]。
　　3.2實驗分為空白組、模型組、皂莢提取物低劑量組、皂莢提取物中劑量組、皂莢提取物高劑量組、索拉菲尼組6組。采用蛋白印跡法和實時熒光定量 PCR法分別檢測各組 VEGF、HIF-1α、PI3K、AKT、mTOR的表達。
　　3.3實驗分為空白

9、組、模型組、皂莢提取物低劑量組、皂莢提取物中劑量組、皂莢提取物高劑量組、索拉菲尼組6組。分別進行各組大鼠的肝臟病理切片的檢測和一般形態(tài)學(xué)的觀察。
　　4.統(tǒng)計學(xué)處理
　　應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理。兩組間比較用t檢驗,三組間比較采用方差分析，觀察指標采用x±s表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　三、實驗結(jié)果：
　　1.不同組別的肝癌組織中MVD的表達
　　實驗結(jié)果顯示，各個組

10、別與空白組比較，MVD值均有明顯的增加（P＜0.01）；各個給藥組與模型組相比較，MVD值均有明顯的下降（P＜0.01）。此結(jié)果表明MVD在肝癌大鼠組織中明顯高于正常組；當(dāng)給予藥物治療后，大鼠肝癌組織趨于好轉(zhuǎn)，MVD也有所下降，提示MVD與肝癌的生長、浸潤、預(yù)后密切相關(guān)。同時各個給藥組之間 MVD的變化沒有明顯的差異（P>0.05），提示皂莢提取物與索拉菲尼均可防治原發(fā)性肝癌，且二者的效果差異不大。
　　2.蛋白印跡法檢測皂莢提取

11、物對肝癌大鼠 HIF-1α、VEGF、PI3K、AKT、mToR表達的影響
　　2.1不同組別對AKT分子表達的影響
　　其它各個組別分別與空白組和模型組比較，AKT的表達都有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；皂莢提取物低劑量組和中劑量組AKT與索拉菲尼組比較、皂莢提取物中劑量組和皂莢提取物高劑量組AKT與皂莢提取物低劑量組比較有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；其他組之間沒有明顯的差異（P>0.05）。此結(jié)果表明AKT在肝癌大鼠

12、組織中明顯高于正常組；當(dāng)給予不同類型和濃度的藥物進行治療后，AKT也有不同程度下降，提示肝癌的生長、浸潤、預(yù)后與AKT的表達密切相關(guān)。結(jié)論提示皂莢提取物高劑量組與索拉菲尼在降低原發(fā)性肝癌中AKT表達的效果比較顯著，且二者的效果差異不大。
　　2.2不同組別對PI3K分子表達的影響
　　皂莢提取物中低劑量組和模型組與空白組比較、皂莢提取物中高劑量組和索拉菲尼組與模型組比較、皂莢提取物低劑量組和中劑量組與索拉菲尼組比較、皂莢提取

13、物高劑量組與低劑量組比較均有顯著性差異（P＜0.01）；空白組與皂莢提取物高劑量組比較、皂莢提取物低劑量組與模型組比較、皂莢提取物中劑量組與皂莢提取物低劑量組比較均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。此結(jié)果表明PI3K在肝癌大鼠組織中明顯高于正常組；當(dāng)給予不同類型和濃度的藥物進行治療后，PI3K也有不同程度下降，提示肝癌的生長、浸潤、預(yù)后與PI3K的表達作用密切。此結(jié)論提示皂莢提取物高劑量組與索拉菲尼在降低原發(fā)性肝癌PI3K表達的效果比較顯著

14、，且二者的效果差異不大。
　　2.3不同組別對mToR分子表達的影響
　　皂莢提取物各劑量組和模型組與空白組比較、皂莢提取物中高劑量組和索拉菲尼組與模型組比較、皂莢提取物低劑量組和中劑量組mToR與索拉菲尼組比較、皂莢提取物高劑量組與低劑量組比較均有顯著性差異（P＜0.01）；模型組與皂莢提取物低劑量組的mToR比較、索拉菲尼組與皂莢提取物高劑量組比較、皂莢提取物中劑量組與低劑量組比較均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。此結(jié)果表

15、明mToR在肝癌大鼠組織中明顯高于正常組；當(dāng)給予不同類型和濃度的藥物進行治療后，mToR也有不同程度下降，提示肝癌的生長、浸潤、預(yù)后與mToR的表達密切相關(guān)。同時結(jié)論也提示皂莢提取物高劑量組與索拉菲尼在降低原發(fā)性肝癌中mToR表達的效果比較顯著，且二者的效果差異不大。
　　2.4不同組別對HIF-1α分子表達的影響
　　皂莢提取物各劑量組和模型組與空白組比較、皂莢提取物中高劑量組和索拉菲尼組與模型組比較、皂莢提取物低劑量組與

16、索拉菲尼組比較、皂莢提取物高劑量和中劑量組與低劑量組比較均有顯著性差異（P＜0.01）；模型組與皂莢提取物低劑量組比較、索拉菲尼組與皂莢提取物中劑量組比較、空白組與索拉菲尼組比較均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　此結(jié)果表明HIF-1α在肝癌大鼠組織中明顯高于正常組；當(dāng)給予不同類型和濃度的藥物進行治療后，HIF-1α也有不同程度下降，提示肝癌的生長、浸潤、預(yù)后與HIF-1α的表達密切相關(guān)。同時此結(jié)論提示皂莢提取物高劑量組與索拉菲

17、尼在降低原發(fā)性肝癌中HIF-1α表達的效果比較顯著，且二者的效果差異不大。
　　2.5不同組別對VEGF分子表達的影響
　　皂莢提取物中低劑量組和模型組與空白組比較、皂莢提取物中高劑量組和索拉菲尼組與模型組比較、皂莢提取物低劑量組和中劑量組與索拉菲尼組比較、皂莢提取物高劑量與低劑量組比較均有顯著性差異（P＜0.01）；模型組和皂莢提取物中劑量組與皂莢提取物低劑量組比較、索拉菲尼組與皂莢提取物中劑量組比較、索拉菲尼組和皂莢提取

18、物高劑量組與空白組比較均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。此結(jié)果表明VEGF在肝癌大鼠組織中明顯高于正常組；當(dāng)給予不同類型和濃度的藥物進行治后，VEGF也有不同程度下降，提示肝癌的生長、浸潤、預(yù)后與VEGF的表達密切相關(guān)。同時此結(jié)論提示皂莢提取物高劑量組與索拉菲尼在降低原發(fā)性肝癌中VEGF表達的效果比較顯著，且二者的效果差異不大。
　　3.PCR法檢測皂莢提取物對肝癌大鼠HIF-1α、VEGF、PI3K、AKT、mToR表達的影響

19、r>　　3.1不同組別對AKT分子表達的影響
　　皂莢提取物中低劑量組和模型組與空白組比較、皂莢提取物高劑量組和索拉菲尼組與模型組比較、皂莢提取物低劑量組和中劑量組與索拉菲尼組比較、皂莢提取物高劑量組與低劑量組比較均有顯著性差異（P＜0.01）；皂莢提取物高劑量組與空白組比較、模型組與皂莢提取物中劑量組比較、索拉菲尼組與皂莢提取物高劑量組比較、皂莢提取物中劑量組與低劑量組比較均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。此結(jié)果表明AKT在肝癌大

20、鼠組織中明顯高于正常組；當(dāng)給予不同類型和濃度的藥物進行治療后，AKT也有不同程度下降，提示肝癌的生長、浸潤、預(yù)后與AKT的表達作用密切。同時此結(jié)論也提示皂莢提取物高劑量組與索拉菲尼在降低原發(fā)性肝癌AKT表達的效果比較顯著，且二者治療原發(fā)性肝癌效果的差異不顯著。
　　3.2不同組別對PI3K分子表達的影響
　　皂莢提取物中低劑量組和模型組與空白組比較、皂莢提取物高劑量組和索拉菲尼組與模型組比較、皂莢提取物低劑量組和中劑量組與索

21、拉菲尼組比較、皂莢提取物高劑量組與低劑量組比較均有顯著性差異（P＜0.01）；皂莢提取物高劑量組與空白組比較、模型組與皂莢提取物中劑量組比較、皂莢提取物中劑量組與皂莢提取物低劑量組比較均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜
　　0.05）。此結(jié)果表明PI3K在肝癌大鼠組織中明顯高于正常組；當(dāng)給予不同類型和濃度的藥物進行治療后，PI3K也有不同程度下降，提示肝癌的生長、浸潤、預(yù)后與PI3K的表達作用密切。此結(jié)論同時也提示皂莢提取物高劑量組與索拉菲尼在

22、降低原發(fā)性肝癌PI3K表達的效果比較顯著，可以更好地防治原發(fā)性肝癌，且二者的效果差異不大。
　　3.3不同組別對mToR分子表達的影響
　　皂莢提取物中低劑量組和模型組與空白組比較、皂莢提取物中高劑量組和索拉菲尼組與模型組比較、皂莢提取物低劑量組和中劑量組與索拉菲尼組比較、皂莢提取物高劑量組與低劑量組比較均有顯著性差異（P＜0.01）；空白組與高劑量組比較、模型組與低劑量組比較、皂莢提取物中劑量組與皂莢提取物低劑量組比較均有

23、統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。此結(jié)果表明mToR在肝癌大鼠組織中明顯高于正常組；當(dāng)給予不同類型和濃度的藥物進行治療后，mToR也有不同程度下降，提示肝癌的生長、浸潤、預(yù)后與mToR的表達作用密切。此結(jié)論同時也提示皂莢提取物高劑量組與索拉菲尼在降低原發(fā)性肝癌mToR表達的效果比較顯著，可以更好地防治原發(fā)性肝癌，且二者的效果差異不大。
　　3.4不同組別對HIF-1α分子表達的影響
　　皂莢提取物高中低劑量組和模型組與空白組比較、

24、皂莢提取物中高劑量組和索拉菲尼組與模型組比較、皂莢提取物低劑量組與索拉菲尼組比較、皂莢提取物高劑量組與低劑量組比較均有顯著性差異（P＜0.01）；空白組和中藥中劑量組與索拉菲尼組比較、中藥中劑量組與中藥低劑量組比較均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。此結(jié)果表明HIF-1α在肝癌大鼠組織中明顯高于正常組；當(dāng)給予不同類型和濃度的藥物進行治療后，HIF-1α也有不同程度下降，提示肝癌的生長、浸潤、預(yù)后與HIF-1α的表達密切相關(guān)。此結(jié)論同時也提示

25、皂莢提取物高劑量組與索拉菲尼在降低原發(fā)性肝癌中HIF-1α表達的效果比較顯著，且二者的效果差異不大。
　　3.5不同組別對VEGF分子表達的影響
　　皂莢提取物高中低劑量組和模型組與空白組比較、皂莢提取物高劑量組和索拉菲尼組與模型組比較、皂莢提取物低劑量組和中劑量組與索拉菲尼組比較、皂莢提取物高劑量組與低劑量組比較均有顯著性差異（P＜0.01）；空白組與索拉菲尼組比較、皂莢提取物中劑量組與模型組比較、皂莢提取物高低劑量組與皂

26、莢提取物中劑量組比較均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。此結(jié)果表明VEGF在肝癌大鼠組織中明顯高于正常組；當(dāng)給予不同類型和濃度的藥物進行治療后，VEGF也有不同程度下降，提示肝癌的生長、浸潤、預(yù)后與VEGF的表達密切相關(guān)。此結(jié)論同時也提示皂莢提取物高劑量組與索拉菲尼在降低原發(fā)性肝癌中VEGF表達的效果比較顯著，且二者的效果差異不大。
　　4.大鼠肝臟病理切片和一般形態(tài)學(xué)觀察
　　4.1皂莢提取物及索拉菲尼各組對大鼠一般情況的影響

27、
　　空白組：大鼠行動自如；體格健壯；反應(yīng)敏捷；呼吸平穩(wěn)；毛發(fā)整潔光亮；目光有神；飲食正常。
　　模型組：大鼠行動不便，個別步履蹣跚；目光呆滯；體格瘦??；反應(yīng)明顯遲鈍，對周圍環(huán)境的刺激沒有響應(yīng)；呼吸微弱；口角流涎；肌肉僵硬或萎縮；毛發(fā)稀疏；飲食減少；身體蜷縮，抱成一團。
　　低劑量組：大鼠行動不便，步履蹣跚；體格瘦??；目光呆滯；反應(yīng)遲鈍，對周圍環(huán)境的刺激響應(yīng)不及時；呼吸微弱或急促；口角流涎；肌肉萎縮；毛發(fā)松散；飲食較少

28、；身體蜷縮，抱成一團。
　　中劑量組：大鼠行動好轉(zhuǎn)，步履偶爾蹣跚；目光呆滯有所好轉(zhuǎn)；反應(yīng)稍慢，對周圍環(huán)境的刺激響應(yīng)不及時；呼吸微弱或急促；口角流涎減輕；肌肉萎縮或僵硬；毛發(fā)稀疏；飲食增加。
　　高劑量組：大鼠行動自如，和正常組沒有明顯區(qū)別；體格健壯；目光有神；反應(yīng)稍有遲鈍，對周圍環(huán)境的刺激基本能夠及時做出回應(yīng)；呼吸基本平穩(wěn)；口角無流涎；肌肉豐滿，收縮自如；毛發(fā)增加；飲食增加。
　　索拉菲尼組：大鼠體格健壯，行動自如，和

29、正常組沒有明顯區(qū)別；目光有神；反應(yīng)敏捷，對周圍環(huán)境的刺激基本能夠及時做出回應(yīng)；呼吸基本平穩(wěn)；口角無流涎；肌肉豐滿，收縮自如；毛發(fā)整潔光亮；飲食增加。
　　4.2皂莢提取物及索拉菲尼各組對大鼠體重的影響
　　模型組和皂莢提取物低劑量組與空白組比較、皂莢提取物高劑量組和索拉菲尼組與模型組比較、皂莢提取物低劑量組和模型組與索拉菲尼組比較、皂莢提取物高劑量組與皂莢提取物低劑量組比較發(fā)現(xiàn)均有一定的統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；皂莢提取物

30、高、中劑量組和索拉菲尼組與空白組比較、皂莢提取物中劑量組和皂莢提取物低劑量組與模型組比較、皂莢提取物高中劑量組和空白組與索拉菲尼組比較、皂莢提取物高低劑量組與皂莢提取物中劑量組相比較發(fā)現(xiàn)有明顯的差異（P>0.05）；此結(jié)果表明肝癌大鼠的體重明顯低于正常組，當(dāng)給予不同類型和濃度的藥物進行治療后，大鼠的體重也有不同程度的升高。此結(jié)論同時也提示原發(fā)性肝癌大鼠經(jīng)過藥物治療后，皂莢提取物高劑量組與索拉菲尼對大鼠體重影響比較明顯，且二者的效果差異不

31、大。
　　4.3各組大鼠肝臟病理切片觀察
　　正常組：肝小葉結(jié)構(gòu)清晰完整，細胞胞漿胞核均勻，肝細胞索排列整齊,以中央靜脈為中心呈放射狀排列。胞核較大，位于肝細胞中央，整個狀態(tài)均一。肝竇內(nèi)及匯管區(qū)可見少量淋巴細胞浸潤,無纖維組織增生。
　　模型組：肝小葉失去正常結(jié)構(gòu)，大部分肝小葉被腫瘤組織代替，周邊的肝小葉受壓質(zhì)地變實，肝竇擴張，肝血竇周圍可見纖維組織增生。匯管區(qū)明顯增寬,有大量的成纖維細胞、纖維細胞。腫瘤細胞呈圓形，再

32、生活躍，異型性明顯，細胞核染色變深，核質(zhì)比變大，部分出現(xiàn)核固縮和核碎裂現(xiàn)象，腫瘤細胞呈團塊狀分布，有的部分出現(xiàn)凝固性壞死，染色呈深紅色。
　　中藥低劑量組：相對于模型組，肝小葉失去正常結(jié)構(gòu)，一部分肝小葉被腫瘤組織取代；細胞形態(tài)有些許的改善，但是依然出現(xiàn)很嚴重的核固縮現(xiàn)象，核質(zhì)比很大，部分細胞呈團塊狀。肝竇擴張，肝血竇周圍有纖維組織增生。
　　中藥中劑量組：相對于模型組，有較大程度的改善，可明顯看出肝小葉的結(jié)構(gòu)有了一定的恢復(fù)，

33、腫瘤組織、異型性細胞數(shù)量和過塑細胞數(shù)量減少，核質(zhì)比較大的細胞數(shù)量也明顯減少。肝血竇周圍偶爾可見到纖維組織增生。
　　中藥高劑量組：從形態(tài)上來看，肝小葉結(jié)構(gòu)基本清晰完整，細胞胞漿胞核均勻，大部分肝小葉細胞正常，部分細胞有核固縮和異型性的現(xiàn)象，但是相較于模型組，狀態(tài)改善很明顯。肝血竇周圍很少見到纖維組織增生。
　　索拉菲尼組：肝小葉結(jié)構(gòu)基本清晰完整，細胞胞漿胞核均勻，肝細胞索排列整齊,以中央靜脈為中心呈放射狀排列。胞核較大，位于

34、肝細胞中央，整體分布較均一。肝竇內(nèi)及匯管區(qū)可見少量淋巴細胞浸潤,基本沒有纖維組織增生。與正常組相比，有很少部分細胞的形態(tài)出現(xiàn)異型性，無團狀分布現(xiàn)象。
　　四、結(jié)論：
　　1.皂莢提取物各劑量組和索拉菲尼對肝癌大鼠的腫瘤細胞均具有抑制作用，其中皂莢提取物高劑量組和索拉菲尼組的抑制效果最為明顯，且二者之間沒有明顯的差異；皂莢中低劑量組次之，空白組和模型組沒有抑制作用。
　　2.皂莢提取物抑制大鼠原發(fā)性肝癌的機理，從PI3K