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1、目的:通過研究皂莢提取物(乙酸乙酯提取)對(duì)小鼠肝癌細(xì)胞TGF-β/Smads信號(hào)系統(tǒng)調(diào)控的影響,為皂莢提取物(乙酸乙酯提取)是否具有抗肝癌的作用提供參考。
方法:
第一部分:理論探討
1從中醫(yī)理論上闡明痰和腫瘤的關(guān)系。強(qiáng)調(diào)痰、毒和瘀相互影響、相互轉(zhuǎn)化、相互膠著是腫瘤發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵。
2提出從“痰”論治肝癌的可行性。并闡明化痰藥口皂莢”具有抗癌作用的前期研究依據(jù)。
第
2、二部分:皂莢的文獻(xiàn)研究
從皂莢的一般特性研究;皂莢的歷史研究探討;含有皂莢的方劑研究;皂莢的藥理學(xué)研究和皂莢的臨床應(yīng)用等方面闡明皂莢的特點(diǎn)和研究?jī)r(jià)值。
第三部分:實(shí)驗(yàn)研究
我們采用清潔級(jí)的昆明種小鼠60只。通過隨機(jī)方法(隨機(jī)數(shù)字表法)將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為6組,實(shí)驗(yàn)分為陰性對(duì)照組(吐溫80溶劑);皂莢提取物(乙酸乙酯提取)3個(gè)濃度組(26.0mg/d、13.0mg/d、7.8mg/d);陽性對(duì)照組(金龍
3、膠囊組);空白對(duì)照組(不造模組)。每組10只小鼠。造模采用小鼠右腋皮下接種H22肝癌細(xì)胞懸液的方法。造模后第2天到第16天,按實(shí)驗(yàn)分組和要求(每只灌胃量為0.4m1,已經(jīng)配好濃度)進(jìn)行灌胃。造模后第17天處死小鼠,收集標(biāo)本進(jìn)行各項(xiàng)檢查。實(shí)驗(yàn)一:觀察各組小鼠大體情況;各組小鼠死亡率;各組小鼠剝瘤稱重,計(jì)算各組腫瘤抑制率和病理學(xué)觀察。實(shí)驗(yàn)二:檢測(cè)各組小鼠血清中的γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT),堿性磷酸酶(ALP),總蛋白(TP),白蛋白(ALB
4、)和甲胎蛋白(AFP)的濃度。實(shí)驗(yàn)三:實(shí)時(shí)熒光定量的方法檢測(cè)各組小鼠肝臟組織中的Smad4mRNA和Smad7mRNA的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)四:免疫組化的方法檢測(cè)Smad4和Smad7蛋白質(zhì)的表達(dá)。
結(jié)果:
實(shí)驗(yàn)一:皂莢提取物對(duì)接種H22肝癌細(xì)胞荷瘤小鼠一般生物學(xué)特性和病理學(xué)的觀察
1鼠大體觀察:空白對(duì)照組小鼠活動(dòng)正常,精神狀態(tài)很好,毛發(fā)正常,并且有光澤,飲食正常,大小便正常。皂莢提取物(高劑量組),皂莢
5、提取物(中劑量組),皂莢提取物(低劑量組)和陽性對(duì)照組(金龍膠囊組),各組小鼠毛發(fā)脫落、有稀疏感、光澤度欠佳,精神不振,活動(dòng)明顯減少,飲食較空白對(duì)照組明顯減少,飲水少較空白對(duì)照組明顯減少不明顯,大小便情況較空白對(duì)照組少,對(duì)外界反應(yīng)慢。陰性對(duì)照組(溶劑土溫80)的情況類似。右側(cè)前肢接種H22肝癌細(xì)胞的小鼠,接種部位可見大小不等的腫塊。有部分小鼠腹腔部位出現(xiàn)腹部脹大,用指尖觸診,有明顯波動(dòng)感,考慮為形成的腹水。
2昆明種小鼠的
6、死亡率達(dá)21.67%。
3各組小鼠腫瘤重量比較:皂莢提取物(高)平均腫瘤重量2.87±0.34,皂莢提取物(中)平均腫瘤重量3.68±0.34,皂莢提取物(低)平均腫瘤重量3.64±0.36,陽性對(duì)照組平均腫瘤重量2.60±0.36與陰性對(duì)照組平均腫瘤重量4.73±0.40比較明顯降低,P<0.01;陰性對(duì)照組,皂莢提取物(中),皂莢提取物(低)與陽性對(duì)照組比較明顯增高,P<0.01;皂莢提取物(高)與陽性對(duì)照組比較腫瘤重
7、量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P>0.05。
各組小鼠腫瘤抑制率:陽性對(duì)照組為45%;陰性對(duì)照組為0;皂莢提取物高劑量組39%;皂莢提取物中劑量組22%;皂莢提取物低劑量組為23%。
4病理學(xué)觀察:空白對(duì)照組小鼠肝臟的肉眼和顯微鏡下觀察都表現(xiàn)正常,模型組各組小鼠總體上較空白對(duì)照組(非模型組)有更多的不正常的表現(xiàn)。
陰性對(duì)照組,皂莢提取物中劑量組和皂莢提取物低劑量組病理學(xué)觀察:肉眼大體觀察:小鼠的肝臟體積較空白
8、對(duì)照組小鼠明顯增大;質(zhì)地較空白對(duì)照組硬度增強(qiáng);肝臟表面可見多個(gè)散在的灰白結(jié)節(jié)。陰性對(duì)照組最多,皂莢提取物中劑量組和皂莢提取物低劑量組比陰性對(duì)照組略少。光學(xué)顯微鏡下:肝小葉結(jié)構(gòu)不清晰,肝細(xì)胞索排列不整齊。細(xì)胞核形態(tài)明顯異常,肝細(xì)胞有部分細(xì)胞核增大,或核質(zhì)比例增大。
陽性對(duì)照組,皂莢提取物高劑量組病理學(xué)觀察:肉眼大體觀察:小鼠的肝臟體積較空白對(duì)照組小鼠略有增大;質(zhì)地較空白對(duì)照組硬度略有增強(qiáng),但不及陰性對(duì)照組;肝臟表面可以偶見散
9、在的灰白結(jié)節(jié)。陽性對(duì)照組和皂莢提取物高劑量組沒有明顯差別。光學(xué)顯微鏡下:肝小葉結(jié)構(gòu)欠清晰,肝細(xì)胞索排列不整齊。細(xì)胞核形態(tài)異常不明顯。推測(cè)皂莢提取物高劑量組能通過對(duì)肝癌癌瘤有明顯抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用,從而延緩肝癌細(xì)胞造成肝臟組織的進(jìn)一步損傷,從而起到保護(hù)肝臟的目的。
實(shí)驗(yàn)二:皂莢提取物對(duì)接種H22肝癌細(xì)胞荷瘤小鼠肝功能相關(guān)指標(biāo)的影響
小鼠血清GGT水平:陽性對(duì)照組平均值23±2U/L、皂莢提取物組(高)平均值2
10、3±2 U/L與陰性對(duì)照組平均值38±2U/L比較明顯降低,P<0.01;皂莢提取物組(中)平均值27±2U/L,皂莢提取物組(低)平均值37±2U/L與陰性對(duì)照組平均值比較降低P<0.05。皂莢提取物組(中)平均值,皂莢提取物組(低)平均值,陰性對(duì)照組平均值與陽性對(duì)照組平均值比較明顯降低,P<0.01。
小鼠血清ALP水平:陽性對(duì)照組平均值25±5 IU/L、皂莢提取物組(高)平均值34±6 IU/L、皂莢提取物組(中)
11、平均值56土5 IU/L與陰性對(duì)照組平均值90±8 IU/L比較明顯降低,P<0.01;皂莢提取物組(低)平均值75±7水平于陰性對(duì)照組比較降低P<0.05。皂莢提取物組(高)、皂莢提取物組(中),皂莢提取物組(低),陰性對(duì)照組ALP水平于陽性對(duì)照組比較明顯降低,P<0.01。
小鼠血清TP:陽性對(duì)照組平均值70±2、皂莢提取物組(高)平均值65±6、皂莢提取物組(中)平均值59±3和皂莢提取物組(低)平均值58±3的TP
12、水平于陰性對(duì)照組平均值47±4比較明顯增高,P<0.01;。皂莢提取物組(中),皂莢提取物組(低)和陰性對(duì)照組的TP水平于陽性對(duì)照組比較明顯降低,P<0.01。
小鼠血清ALB:陽性對(duì)照組平均值30±2、皂莢提取物組(高)平均值29±1的小鼠ALB水平于陰性對(duì)照組平均值22±2比較明顯增高,P<0.01。皂莢提取物組(中)平均值25±3,皂莢提取物組(低)平均值23±2和陰性對(duì)照組的小鼠ALB水平于陽性對(duì)照組比較明顯降低,
13、P<0.01。
小鼠血清AFP:結(jié)果各組小鼠AFP的數(shù)值均沒有測(cè)出。實(shí)驗(yàn)三:皂莢提取物對(duì)接種H22肝癌細(xì)胞荷瘤小鼠TGF-β/Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路smad4 mRNA和smd7 mRNA表達(dá)的影響
Smad4mRNA表達(dá):擴(kuò)增倍數(shù)陽性對(duì)照組平均值0.566±0.092和皂莢提取物高劑量組平均值0.471±0.069與陰性對(duì)照組平均值0.320±0.099比較明顯增高,P<0.01;皂莢提取物中劑量組平均值0
14、.363±0.058和皂莢提取物低劑量組平均值0.280±0.067與陽性對(duì)照組比較比較明顯降低,P<0.01。
Smad7mRNA表達(dá):擴(kuò)增倍數(shù)陽性對(duì)照組平均值2.007±0.499、皂莢提取物組(高劑量組)平均值2.230±0.491的小鼠肝臟組織中Smad7mRNA表達(dá)水平于陰性對(duì)照組平均值3.537±0.401比較明顯降低,P<0.01。
皂莢提取物組(中劑量組)平均值3.106±0.410,皂莢提取
15、物組(低劑量組)平均值3.613±0.416和陰性對(duì)照組小鼠肝組織中Smad7mRNA表達(dá)水平于陽性對(duì)照組比較明顯增高,P<0.01。
實(shí)驗(yàn)四:皂莢提取物對(duì)接種H22肝癌細(xì)胞荷瘤小鼠TGF-β/Smds信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路smd4和smd7蛋白表達(dá)的影響
Smd4蛋白表達(dá):陽性對(duì)照組的小鼠肝臟Smad4蛋白表達(dá)水平平均值2973.190±248.540與陰性對(duì)照組平均值1196.399±837比較明顯增高,P<0.0
16、1。皂莢提取物組(高劑量組)平均值2295.187±820.119與陰性對(duì)照組比較增高,P<0.05。
陰性對(duì)照組的小鼠肝臟Smad4蛋白表達(dá)水平與陽性對(duì)照組比較明顯降低,P<0.01。皂莢提取物組(中劑量組)平均值1558.835土302.801和皂莢提取物組(低劑量組)平均值988.614±338.995與陽性對(duì)照組比較降低,P<0.05。
Smad7蛋白表達(dá):陽性對(duì)照組平均值1454.381±302.4
17、05和皂莢提取物組(高劑量組)平均值1494.202±399.553的小鼠肝臟Smad7蛋白表達(dá)水平與陰性對(duì)照組平均值2239.589±272.892比較明顯降低,P<0.01。皂莢提取物組(中劑量組)平均值1496.981±505.121與陰性對(duì)照組比較降低,P<0.05。
陰性對(duì)照組和皂莢提取物組(低劑量組)平均值2330.056±177.105的小鼠肝臟Smad7蛋白表達(dá)水平與陽性對(duì)照組比較明顯增高,P<0.01。<
18、br> 結(jié)論:皂莢提取物(乙酸乙酯提取)的抗肝癌的作用可能有下列機(jī)理實(shí)現(xiàn):①改善荷瘤小鼠的生存質(zhì)量而抑制腫瘤對(duì)機(jī)體的損傷。②通過抑制接種部位腫瘤體的大小而起到抗癌的作用。③通過保護(hù)荷瘤小鼠的肝臟功能而起到保護(hù)肝臟的作用④皂莢提取物高劑量組(26.0mg/d)能通過增強(qiáng)Smad4mRNA的表達(dá)和下調(diào)Smad7mRNA的表達(dá)。⑤皂莢提取物高劑量組(26.0mg/d)能通過增強(qiáng)Smad4蛋白的表達(dá)和下調(diào)Smad7蛋白的表達(dá)。綜合起到抗癌
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