酪絲亮肽對肝癌的治療作用及影響腫瘤細胞信號傳導的機理研究.pdf

1、目的： 研究三肽化合物酪絲亮肽(YSL)在體內外的抗肝癌作用，并初步探討其損傷腫瘤細胞線粒體，抑制其增殖和誘導死亡的機制。 方法： 1．以人肝癌細胞株 BEL-7402、SMMC-7721、Hep3B、HepG2、SK-HEP-1 和人正常肝細胞株 Chang 氏肝、HL7702 為研究對象，應用MTS法和中空纖維測定法觀察YSL在體內外對肝癌細胞和正常肝細胞增殖的影響；建立裸鼠移植瘤模型，觀察YSL對BEL-7

2、402腫瘤生長的抑制作用，并以透射電鏡觀察YSL對裸鼠移植瘤腫瘤細胞超微結構的影響。 2．應用流式細胞術觀察YSL體外對人肝癌BEL-7402細胞周期的影響；并以流式細胞術、DNA Ladder檢測和Nucleosome ELISA 的方法觀察YSL體外對人肝癌BEL-7402細胞的誘導凋亡作用。 3．應用基因芯片技術分析YSL對人肝癌BEL-7402裸鼠移植瘤腫瘤細胞基因表達譜的影響。 4．以流式細胞儀和熒光檢

3、測儀觀察YSL體外對人肝癌BEL-7402細胞線粒體通透性轉變孔開放，線粒體膜電位和細胞內鈣離子濃度的影響。 5．應用Western Blot 方法，觀察YSL 體外對人肝癌BEL-7402細胞線粒體凋亡抑制因子Bcl-2和Bcl-X<,L>蛋白表達的影響；分離腫瘤細胞的胞漿組分，觀察YSL對BEL-7402細胞線粒體釋放促凋亡物質細胞色素C和激活半胱天冬酶Caspase-3 的影響；觀察 YSL 對腫瘤細胞鈣穩(wěn)態(tài)調節(jié)蛋白鈣網蛋

4、白(Calreticulin) 和內質網凋亡通路的 Capase-12 蛋白表達的影響6．應用實時熒光定量PCR和Western Blot方法觀察，觀察YSL體外對人肝癌BEL-7402細胞P13K信號通路調節(jié)和效應因子PTEN、Akt、PDK1、P21、P27、PDK1、MDM2、P53和Bad的mRNA和蛋白表達，以及磷酸化修飾的影響。 結果： 1.YSL 在體外(0.4～3.2mg/ml)和體內(320～640μg

5、/kg/d)均能夠明顯抑制前述五種人肝癌細胞株的增殖(P<0.05)，但對正常人肝細胞株HL7702和Chang氏肝則沒有明顯影響(P>0.05)；組成酪絲亮肽三種氨基酸等摩爾比混合物對腫瘤細胞的增殖沒有抑制作用，YSL的抗腫瘤作用機制與其小分子多肽的結構有關；YSL(320μg/kg/d、640μg/kg/d)能夠明顯抑制人肝癌BElL-7402裸鼠移植瘤的生長(P<0.05)，腫瘤生長抑制率分別為40.04％和52.85％。超微結構

6、研究發(fā)現(xiàn)，YSL可引起腫瘤細胞的染色質溶解，線粒體腫脹，溶解，內質網擴張，細胞出現(xiàn)壞死和凋亡。 2.基因芯片分析結果顯示YSL可以抑制腫瘤細胞線粒體呼吸鏈功能相關基因表達，影響鈣穩(wěn)態(tài)調節(jié)基因以及與腫瘤細胞增殖相關基因的表達，影響腫瘤細胞的信號轉導通路基因，還可調節(jié)與藥物代謝相關基因、癌基因/抑癌基因的表達。 3.YSL(0.8，1.6mg/ml)能夠在體外阻抑人肝癌 BEL-7402 細胞的細胞周期，使G<,0>/G<,

7、1>期細胞百分比明顯增高，S期百分比明顯降低(P<0.05)；能夠使凋亡細胞數明顯增多，增加腫瘤細胞凋亡核小體DNA的產生數量，形成明顯的DNA Ladder。 4.YSL(0.8，1.6mg/ml)能夠在體外激活BEL-7402細胞線粒體通透性轉變孔的開放，降低線粒體膜電位，影響線粒體膜的通透性，增加腫瘤細胞中的鈣離子濃度。 5.YSL能夠在體外抑制BEL-7402細胞中抗凋亡因子Bcl-2和Bcl-X<,L>的蛋白表

8、達，誘導線粒體釋放促凋亡物質細胞色素C，增加活化Caspase-3 的數量；YSL能夠增加BEL-7402細胞中內質網鈣穩(wěn)態(tài)調節(jié)蛋白Calreficulin和內質網凋亡通路的Capase-12的蛋白表達。 6.YSL能夠上調腫瘤細胞中抑癌基因PTEN的表達和活性，抑制癌基因Akt的表達和活性，以及Akt相關蛋白激酶PDK1的活性。并籍此影響Akt通路的下游事件達到抗腫瘤效應：增加P21、P27的表達阻抑細胞周期，抑制腫瘤增殖；通

9、過使癌基因MDM2蛋白產物失活，穩(wěn)定抑癌因子P53的數量，促進腫瘤死亡；解除對促凋亡因子Bad的磷酸化抑制，損傷腫瘤細胞線粒體，誘導腫瘤凋亡。 結論： YSL能夠在體內外明顯抑制肝癌細胞的增殖，阻抑腫瘤細胞的細胞周期，誘導凋亡和壞死，而對正常肝細胞無明顯影響。其作用機制可能是通過損傷腫瘤細胞線粒體膜，激活MPTP孔開放，降低線粒體膜電位，進而影響線粒體膜通透性，使線粒體中的鈣離子，細胞色素C等促凋亡物質釋放到胞漿中，激活