南蛇藤抗炎及免疫抑制活性部位的研究.pdf

1、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種慢性的、致殘性自身免疫性疾病，其發(fā)病率為0.3%-1%，我國(guó)大約有400萬(wàn)患者。治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的常規(guī)用藥包括糖皮質(zhì)激素（例如，可的松和強(qiáng)的松），非甾體抗炎藥物（NSAIDS；布洛芬和萘普生），緩解病情的抗風(fēng)濕藥物（DMARDs；甲胺喋呤（MTX）和來(lái)氟米特），生物制劑（腫瘤壞死因子-α抑制劑）。除了其高成本外，長(zhǎng)期使用過(guò)多的上述藥物通常導(dǎo)致嚴(yán)重的不良反應(yīng)及毒副反應(yīng)，還包括正在接受生物制劑治療患者的多系統(tǒng)感染風(fēng)險(xiǎn)。

2、因此，基于中藥或天然植物產(chǎn)品類(lèi)的補(bǔ)充和替代藥物（CAM）的替代療法，由于其較好的臨床療效、較少的毒副作用及可長(zhǎng)期用藥的可能性，越來(lái)越受到臨床醫(yī)學(xué)的重視及患者的歡迎。 南蛇藤屬衛(wèi)矛科南蛇藤屬植物，中國(guó)民間以根，莖，葉和藤用于治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、腰痛等病證。過(guò)山楓（Celastrus aculeatus Merr）是南蛇藤屬植物，在中醫(yī)臨床上作為南蛇藤藥材來(lái)源之一。我們的前期藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)已證明，過(guò)山楓乙醇提取物具有抗炎及鎮(zhèn)痛

3、作用，對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)炎癥具有顯著的抑制作用。但是，過(guò)山楓中究竟是哪些成分在發(fā)揮藥效作用，迄今為止國(guó)內(nèi)外尚無(wú)研究報(bào)告。闡明過(guò)山楓中抗炎及抑制免疫的活性部位及有效成分，對(duì)過(guò)山楓的藥物開(kāi)發(fā)將具有重要的意義。 本課題采用藥理學(xué)追蹤指導(dǎo)化學(xué)活性分離的方法，應(yīng)用現(xiàn)代層析技術(shù)及波譜方法從過(guò)山楓中分離活性部位并鑒定代表化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)；同時(shí)，運(yùn)用快速細(xì)胞培養(yǎng)MTT的實(shí)驗(yàn)手段，從體外的角度驗(yàn)證過(guò)山楓活性部位對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用，以期明

4、確其抗炎及抑制免疫的活性部位，并發(fā)現(xiàn)該部位中的代表化合物，作為質(zhì)量控制的參考。 1.南蛇藤屬植物資源調(diào)查 目的：概述南蛇藤屬植物的種屬分類(lèi)，形態(tài)特征及地理分布，了解南蛇藤屬化學(xué)成分及藥理活性的研究進(jìn)展。 方法：采用本草考證和文獻(xiàn)調(diào)研的方法對(duì)南蛇藤屬植物的研究進(jìn)展做一綜述。 結(jié)果：我國(guó)產(chǎn)南蛇藤屬植物30種，分布廣泛；迄今為止共從南蛇藤屬植物中分離得到最多的成分是倍半萜及倍半萜衍生物，其中得到148余種倍半萜

5、，主要存在于該屬植物的根皮、葉、種子中。三萜類(lèi)成分主要存在于南蛇藤屬植物的根皮中，主要類(lèi)型有羽扇豆烷型和齊墩果酸型。目前報(bào)道的大約有14種，其中報(bào)道最多見(jiàn)的是南蛇藤素。在南蛇藤屬植物中還發(fā)現(xiàn)了二萜成分，到目前為止報(bào)道的有4種。黃酮類(lèi)化合物主要存在于南蛇藤屬植物的葉中。另有其它幾類(lèi)物質(zhì)。南蛇藤屬植物及其提取物或成分具有多種生理藥理活性。這些生理藥理活性主要包括抗腫瘤、抗炎及抗病原微生物作用；抗生育作用和抗氧化作用。以及昆蟲(chóng)拒食作用、松弛平

6、滑肌作用、抑菌抑病毒作用等。 結(jié)論：南蛇藤屬植物資源豐富，價(jià)廉易得，而其中發(fā)現(xiàn)的大部分化學(xué)成分藥理活性明確，且目前所用于治療的疾病多為臨床疑難雜癥.所以具有很好的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。 2.過(guò)山楓抗炎及免疫抑制部位的提取分離 目的:過(guò)山楓（Celastrus aculeatus Merr）中的抗炎及免疫抑制部位活性部位提取分離方法的研究 方法:95%食用乙醇提取過(guò)山楓粗粉，水沉工藝除雜，獲得過(guò)山楓乙醇浸膏。稱取過(guò)

7、山楓醇提物，以適量硅藻土拌樣，投入索氏提取器中，以20倍量石油醚/乙酸乙酯/正丁醇分別進(jìn)行提取。獲得不同極性的部位。經(jīng)化學(xué)方法和體外生物學(xué)方法檢測(cè)后，確定過(guò)山楓抗炎活性部位。 結(jié)果:初步確定過(guò)山楓中總?cè)铺崛》蛛x工藝及方法。 結(jié)論:經(jīng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)證明過(guò)山楓乙醇提取物的乙酸乙酯部分可能為三萜富集部位，具有一定抗炎活性。 3.過(guò)山楓總?cè)贫ㄐ远繙y(cè)定 目的:建立過(guò)山楓（Celastrus aculeatus Me

8、rr）總?cè)铺崛∥锒ㄐ远繙y(cè)定方法。 方法;以TLC方法，試驗(yàn)不同溶劑系統(tǒng)上行展開(kāi)，采用硫酸乙醇，加熱顯色，建立過(guò)山楓所含的總?cè)贫ㄐ詼y(cè)定方法。采用香草醛-冰醋酸、高氯酸比色法，建立過(guò)山楓提取物中的總?cè)祁?lèi)成分含量測(cè)定方法。 結(jié)果:過(guò)山楓中三萜類(lèi)成分TLC條件為：石油醚：乙酸乙酯：氯仿：冰醋酸=6：2：1：0.1；以10%硫酸乙醇于120℃顯色5分鐘，可見(jiàn)紫紅色或藍(lán)紫色斑點(diǎn)。過(guò)山楓總?cè)祁?lèi)成分平均含量為37.93%，RS

9、D=1.60%（n=5）；過(guò)山楓藥材總?cè)祁?lèi)成分平均含量為12.87%，RSD=3.39%（n=5）。過(guò)山楓乙醇提取物石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位總?cè)祁?lèi)成分平均含量分別為41.57%，RSD=3.28%（n=5）；48.34%，RSD=2.97%（n=5）；39.82%，RSD=4.13%（n=5）。 結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)所建立的方法可作為南蛇藤藥材及提取物總?cè)瀑|(zhì)量評(píng)估的一種檢測(cè)手段。 4.過(guò)山楓不同極性部位對(duì)體外培

10、養(yǎng)小鼠淋巴細(xì)胞增殖作用的影響 目的:檢測(cè)過(guò)山楓不同極性提取物對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞增殖作用的影響。 方法:采用小鼠脾淋巴細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，觀察過(guò)山楓不同活性部位對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用，以四甲基偶氮唑鹽（MTT）比色分析法進(jìn)行測(cè)定。 結(jié)果:石油醚1組、乙酸乙酯1組、正丁醇2組與ConA組相比較，結(jié)果有顯著性差異。（*P<0.05） 結(jié)論:過(guò)山楓乙醇提取物石油醚1組、乙酸乙酯1組、正丁醇2組與ConA組相比較，對(duì)小

11、鼠T淋巴細(xì)胞增殖均有明顯的抑制作用。其中以石油醚1組、乙酸乙酯1組的作用更強(qiáng)。且各組抑制作用均表現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。 5.過(guò)山楓醇提物乙酸乙酯部位柱分離及鑒定 方法:提取過(guò)山楓乙醇提取物的乙酸乙酯部分，并進(jìn)行反復(fù)柱色譜，以光譜方法對(duì)分離得到的單體進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。 結(jié)果:離并鑒定了1個(gè)化合物，共獲得結(jié)晶97mg，得率為0.47%，鑒定為β-谷甾醇。 結(jié)論:該化合物在過(guò)山楓抗炎活性部位中含量較高，且為首次在該植