南蛇藤素對CYPs的誘導(dǎo)及該誘導(dǎo)作用與其抗炎活性的關(guān)系研究.pdf

1、第一部分南蛇藤素對CYPs的誘導(dǎo)作用的研究
　　目的:
　　南蛇藤素（celastrol）是中藥雷公藤（Tripterygium Wilfordii.Hook.f.）等的主要活性成分之一，在臨床上可能與其他藥物聯(lián)用治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病。為探討南蛇藤素是否可能與聯(lián)用的藥物發(fā)生基于藥物代謝的藥藥相互作用(DDI)，本研究考察了南蛇藤素對大鼠原代肝細胞內(nèi)細胞色素P450（Cytochrome P450，CYPs）的表達調(diào)節(jié)作用

2、。
　　方法:
　　兩步膠原酶灌注法提取Wistar大鼠原代肝細胞，培養(yǎng)12h后用南蛇藤素處理。采用熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測南蛇藤素處理后大鼠原代肝細胞內(nèi)CYPs的mRNA的變化，采用蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)檢測蛋白的表達變化，采用LC/MS/MS檢測S9體外代謝CYP2C、2D和3A的特異性底物生成4-羥基雙氯芬酸、1-羥基丁呋洛爾和6β-羥基睪酮的速率變化來考察酶活性變化情況。數(shù)

3、據(jù)采用GraphPad Prism5軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　結(jié)果:
　　1、南蛇藤素能夠明顯誘導(dǎo)大鼠原代肝細胞內(nèi)在藥物代謝中發(fā)揮主要作用的CYP2C、CYP2D和CYP3A家族成員的表達。CYP2C12，CYP2D2，CYP3A1和CYP3A9 mRNA的表達被顯著誘導(dǎo)，而對CYP2C7和CYP2C11的mRNA水平無顯著影響。該誘導(dǎo)作用也反映在蛋白水平的變化上。
　　2、南蛇藤素作用于大鼠原代肝細胞后，CYP2C、

4、CYP2D和CYP3A的酶活性也升高。
　　結(jié)論:
　　南蛇藤素能夠誘導(dǎo)大鼠原代肝細胞內(nèi)在藥物代謝中發(fā)揮主要作用的CYP2C、2D和3A的表達和酶活性。當(dāng)與雷公藤制劑同服的藥物受上述三個家族成員代謝時，可能會發(fā)生基于代謝酶誘導(dǎo)的DDI，導(dǎo)致同服藥物的代謝清除加快并影響藥效。
　　第二部分南蛇藤素對CYPs誘導(dǎo)作用的調(diào)控機制研究
　　目的:
　　南蛇藤素對大鼠原代肝細胞內(nèi)多種CYPs有誘導(dǎo)作用，探討南蛇藤素誘

5、導(dǎo)CYPs的作用機制，可為南蛇藤素的合理使用提供理論依據(jù)。研究表明核受體PXR和CAR及轉(zhuǎn)錄因子p53和NF-κB能夠調(diào)控CYPs的表達。因此，本研究將從核受體、p53和NF-κB三個方面入手，考察南蛇藤素對CYPs的誘導(dǎo)機制。
　　方法:
　　兩步膠原酶灌注法提取大鼠原代肝細胞，培養(yǎng)12h后用南蛇藤素處理，采用熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測南蛇藤素處理大鼠原代肝細胞后，核受體PXR和CAR的mRNA和蛋白

6、表達情況進行分析，并對PXR和CAR下游基因P-gp mRNA的變化進行檢測以分析上述核受體的功能。采用蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)檢測p53、IκBα和NF-κB蛋白的表達情況，并結(jié)合特異性抑制劑考察受南蛇藤素影響的轉(zhuǎn)錄因子被抑制后，南蛇藤素對大鼠原代肝細胞內(nèi)CYPs的mRNA誘導(dǎo)的變化情況。數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism5軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　結(jié)果:
　　1、南蛇藤素作用后，大鼠原代肝細胞內(nèi)CAR

7、和PXR的mRNA和蛋白質(zhì)并未被誘導(dǎo)，進一步對其活性進行分析發(fā)現(xiàn)其下游基因P-gp的mRNA發(fā)生了下調(diào)。該結(jié)果表明核受體CAR和PXR的活性可能被南蛇藤素抑制，提示上述核受體并未參與南蛇藤素對CYPs的誘導(dǎo)。
　　2、南蛇藤素對p53的蛋白水平無顯著影響。該結(jié)果表明南蛇藤素可能不通過p53誘導(dǎo)CYPs表達。
　　3、南蛇藤素能夠明顯抑制NF-κB蛋白的表達，呈一定的劑量依賴性。南蛇藤素與NF-κB抑制劑共同處理大鼠原代肝細胞

8、后，南蛇藤素對CYP2C12，CYP2D2和CYP3A1 mRNA的誘導(dǎo)作用受到了抑制。
　　結(jié)論:
　　南蛇藤素對CYPs的誘導(dǎo)作用機制可能至少部分是通過下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的表達，從而解除了NF-κB對CYPs的抑制作用。核受體PXR和CAR以及轉(zhuǎn)錄因子p53可能在該過程中不發(fā)揮作用。
　　第三部分南蛇藤素誘導(dǎo)CYPs在炎癥中的作用
　　目的:
　　CYP2C能將花生四烯酸(AA)轉(zhuǎn)化為環(huán)氧二十碳三烯

9、酸(EET)，具有抗炎作用，而炎癥中CYP2C下調(diào)。本研究前兩部分研究結(jié)果表明南蛇藤素可誘導(dǎo)的CYP2C的活性。該結(jié)果提示南蛇藤素對CYP2C的誘導(dǎo)可能在其抗炎活性中發(fā)揮作用。因此，本部分?jǐn)M考察南蛇藤素對CYPs的誘導(dǎo)作用是否參與了其抗炎機制。
　　方法:
　　兩步膠原酶灌注法提取大鼠原代肝細胞，培養(yǎng)12h后藥物處理。LPS處理大鼠原代肝細胞后，用SRB法檢測細胞生存率的改變，結(jié)合ELISA法檢測TNF-α和IFN-γ分泌的

10、變化，考察炎癥誘導(dǎo)情況。在CYPs聯(lián)合南蛇藤素共同處理LPS誘導(dǎo)的大鼠原代肝細胞，ELISA法檢測TNF-α和IFN-γ的分泌變化。
　　結(jié)果:
　　1、5μg/ml LPS可在大鼠原代肝細胞水平誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。
　　2、在大鼠原代肝細胞中，南蛇藤素與CYPs抑制劑共同處理與南蛇藤素單獨處理相比，LPS誘導(dǎo)的大鼠原代肝細胞中TNF-α和IFN-γ的分泌并無明顯變化。該結(jié)果表明抑制南蛇藤素誘導(dǎo)的CYPs對南蛇藤素抗炎活性沒