依博素抗炎作用機(jī)理的研究.pdf

1、依博素是從鏈霉菌139發(fā)酵產(chǎn)物中獲得的新天然產(chǎn)物，已獲國家發(fā)明專利。臨床前研究已完成，正在申報(bào)治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的臨床研究。藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，依博素對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型（大鼠佐劑型關(guān)節(jié)炎模型和大鼠Ⅱ型膠原性關(guān)節(jié)炎模型）具有顯著抑制作用，在依博素的作用下兩種模型動(dòng)物的IL-1β和TNFα分泌水平均顯著下降，上述結(jié)果說明依博素對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的抑制作用可能和降低上述炎癥細(xì)胞因子相關(guān)。
　　類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是自身免疫性疾病，

2、嚴(yán)重影響人類健康，目前尚缺乏有效治療手段。研究表明炎癥細(xì)胞因子白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子α(TNFα)和白細(xì)胞介素6(IL-6)在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的病理過程中起重要作用，抑制其分泌表達(dá)并降低其生物活性已成為研制治療RA新藥的主要途徑。
　　為了確定依博素治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)理，本論文在細(xì)胞水平開展了其對炎癥細(xì)胞因子IL-1β、IL-6及TNFα分泌表達(dá)及信號傳導(dǎo)途徑的作用。
　　本課題從Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的類風(fēng)

3、濕性關(guān)節(jié)炎模型(CIA)大鼠，成功分離獲得滑膜細(xì)胞株(FLS)，建立了細(xì)胞培養(yǎng)條件;采用該細(xì)胞株及人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞株(THP-1)開展了本項(xiàng)研究。
　　在CIA-FLS細(xì)胞和THP-1細(xì)胞中，采用熒光標(biāo)記底物，分別證明了依博素對IL-1β轉(zhuǎn)化酶(ICE)和TNFα轉(zhuǎn)化酶(TACE)活性的抑制作用;采用實(shí)時(shí)定量PCR(real-time PCR)確定了依博素對上述炎癥細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平的降低作用;利用酶聯(lián)免疫吸附方法(

4、ELISA)及Western blotting檢測，證明依博素對3種炎癥細(xì)胞因子的抑制作用，上述結(jié)果證明依博素分別作用各細(xì)胞因子基因轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后蛋白水平，從而抑制了上述細(xì)胞因子的分泌表達(dá)。
　　在CIA-FLS細(xì)胞中，研究了依博素對炎癥細(xì)胞因子IL-1β、IL-6及TNFα信號傳遞途徑的作用。Western blotting檢測表明，依博素通過降低磷酸化p38、JNK1和JNK2蛋白水平，分別抑制IL-1β和TNFα的MAPK

5、/AP-1信號傳導(dǎo)途徑;采用Westernblotting分析顯示，依博素抑制磷酸化IKKα和IKKβ、磷酸化IκB和細(xì)胞核NF-κB的蛋白水平;凝膠遷移實(shí)驗(yàn)(EMSA)證明依博素可有效抑制細(xì)胞核NF-κB與DNA的結(jié)合;采用免疫熒光檢測法證明依博素對NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核有明顯抑制作用，上述實(shí)驗(yàn)分別證明依博素對IL-1β和TNFα的IKK/NF-κB信號傳導(dǎo)途徑抑制作用顯著。采用Western blotting分析方法，確定了依博素能有

6、效降低細(xì)胞磷酸化JAK2、STAT1和STAT3蛋白水平，免疫熒光檢測法表明其對STAT3進(jìn)入細(xì)胞核有一定的抑制作用，上述實(shí)驗(yàn)證明了依博素能抑制IL-6的JAK/STAT信號傳導(dǎo)途徑。
　　采用ELISA分析證明，在IL-1β和TNFα分別誘導(dǎo)下，依博素可以降低CIA-FLS細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-1、MMP-3和化學(xué)趨化因子IL-8、RANTES的分泌水平。
　　綜上所述，本研究首次在細(xì)胞水平證明，依博素對炎癥細(xì)胞因子I