經腰椎穿刺注射干細胞內耳移植新途徑的探索研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分進行論述：
　　第一部分 人臍帶間充質干細胞和誘導多能干細胞的培養(yǎng)與鑒定
　　目的：培養(yǎng)人臍帶間充質干細胞及人誘導多能干細胞，對細胞進行鑒定。對兩種細胞進行比較，探討適用于大量培養(yǎng)以滿足體內移植治療的細胞類型。
　　方法：使用組織塊貼壁法從臍帶組織中分離人臍帶間充質干細胞。培養(yǎng)、鑒定人臍帶間充質干細胞及人誘導多能干細胞，繪制兩種細胞的生長曲線，并比較細胞形態(tài)。
　　結果：組織塊貼壁法成功分離

2、間充質干細胞，經鑒定其表型CD73(+)，CD105(+)，CD31（-），CD34（-），符合臍帶間充質干細胞特點。誘導多能干細胞NANOG(+)、OCT-4(+)、SOX-2(+)、SSEA-4(+)、TRA-60(+)和TRA-81(+)，符合誘導多能干細胞特點。臍帶間充質干細胞呈梭形，以漩渦樣排列，其倍增時間約42小時。誘導多能干細胞呈圓形或橢圓形，呈集落生長，其倍增時間約18小時。
　　結論：人臍帶間充質干細胞及誘導多能

3、干細胞增殖速度快，狀態(tài)穩(wěn)定，適合用于以移植治療為目的的大量繁殖。
　　第二部分 經腰椎穿刺干細胞內耳移植注射新途徑的探索研究
　　目的：摸索建立一種在人類感音神經性耳聾大型哺乳動物模型上可行的內耳干細胞移植方法，檢測經腰椎穿刺蛛網膜下腔注射移植的人誘導多能干細胞在Mitf基因突變耳聾豬的內耳及全身的分布情況，檢測對聽性腦干反應閾值的影響。
　　方法：培養(yǎng)及鑒定人誘導多能干細胞。選擇Mitf基因突變的榮昌豬作為神經性耳聾

4、模型的實驗對象，移植干細胞的榮昌豬為實驗組，單純注射生理鹽水的榮昌豬為對照。將人誘導多能干細胞經蛛網膜下腔注射的途徑移植到實驗組榮昌豬體內。設置觀察期為移植后1天、移植后3天和移植后7天，在移植前和處死前行全身麻醉后測定聽性腦干反應閾值。按觀察期的時間點處死動物取耳蝸及其他組織。制作冰凍組織切片，行免疫組織熒光染色，用人特異性抗體檢測供體細胞。提取蛋白質，使用蛋白印跡法檢測移植細胞蛋白的表達。提取RNA，使用RT-PCR法檢測供體細胞基

5、因在實驗對象體內分布。
　　結果：經蛛網膜下腔穿刺注射的人誘導多能干細胞在移植后可以在實驗對象內耳檢出;同過蛋白質印跡法在移植后1天、3天和7天可以在內耳、腰椎段脊髓、胸椎段脊髓、頸椎段脊髓、延髓、小腦、大腦、心、肝、脾、肺、腎中檢出移植細胞的蛋白表達。通過RT-PCR方法移植后1天、3天和7天可以在腰椎段脊髓、胸椎段脊髓、頸椎段脊髓、延髓、小腦、大腦、心、肝、脾、肺、腎中檢出移植細胞的基因表達。在移植前后，Mitf基因突變榮昌豬