超低頻經(jīng)顱磁刺激對(duì)局部腦缺血再灌注損傷大鼠海馬區(qū)齒狀回內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖、遷移與分化的影響.pdf

1、隨著國民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展及人口結(jié)構(gòu)老年化，腦血管病已經(jīng)成為危害我國中老年人身體健康和生命的主要疾病，其中缺血性腦卒中約占腦血管病75％。腦卒中患者常存在不同程度的肢體運(yùn)動(dòng)功能受損、失語、認(rèn)知精神障礙等，直接影響患者生活質(zhì)量和康復(fù)治療效果，給家庭和社會(huì)帶來巨大的傷害和沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為神經(jīng)損傷后難以再生，神經(jīng)功能的缺失是永久的，不能恢復(fù)。近年來的研究證實(shí)，成年嚙齒類動(dòng)物腦組織的側(cè)腦室下區(qū)及海馬區(qū)存在內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞，在受到缺血缺氧、外

2、傷、癲癇、生長因子等因素刺激下，可持續(xù)活化，發(fā)生增殖、遷移及分化，對(duì)受損神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)修復(fù)和神經(jīng)功能重建中發(fā)揮作用，為腦卒中等腦血管疾病的治療提供了新的突破口。然而，許多研究揭示腦缺血后雖然可引起海馬區(qū)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的神經(jīng)發(fā)生，但內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的數(shù)量不足，而且某些調(diào)節(jié)遷移、分化、存活、神經(jīng)元修復(fù)和突觸形成的因子也不足。因此，進(jìn)一步研究并利用生物化學(xué)及物理因素等方法來擴(kuò)大內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)生，促進(jìn)其增殖，并向缺血壞死灶遷移，促進(jìn)其分化成為

3、神經(jīng)細(xì)胞，對(duì)修復(fù)腦卒中后神經(jīng)系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)，提高大腦的可塑性，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)具有重要的研究意義。
　　經(jīng)顱磁刺激(Transcranial Magnetic Stimulation，TMS)是基于快速電磁轉(zhuǎn)換原理，利用磁場作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，使大腦皮層及皮層下神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生感應(yīng)性生物電流，影響腦內(nèi)代謝過程及神經(jīng)細(xì)胞電活動(dòng)，從而引起一系列生理生化效應(yīng)的非侵入性技術(shù)。超低頻經(jīng)顱磁刺激(Infra-low-frequency transcr

4、anialmagnetic stimulation，ILF-TMS)是刺激頻率0～0.2Hz之間的磁刺激。目前大多數(shù)對(duì)TMS的研究頻率均在Hz水平，針對(duì)更低刺激頻率的研究則比較少。大量的臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，ILF-TMS在治療腦損傷疾病如帕金森病、抑郁、腦血管疾病等和精神類疾病如抑郁、焦慮、失眠等取得了良好的效果。有研究證實(shí)，采用ILF-TMS治療缺血性腦卒中，可明顯改善病人包括精細(xì)動(dòng)作等的運(yùn)動(dòng)功能、看圖識(shí)物能力、命名能力及語言表達(dá)能力

5、。ILF-TMS可通過干預(yù)神經(jīng)遞質(zhì)的活性影響腦的功能，具有特殊的生物物理特性及臨床應(yīng)用價(jià)值。隨著ILF-TMS應(yīng)用領(lǐng)域的不斷拓寬，其治療機(jī)制的問題也日益受到人們的重視。目前的許多研究提示ILF-TMS治療CNS疾病可能通過影響eNSCs而發(fā)揮作用，如ILF-TMS可促進(jìn)海馬齒狀回BDNF，5-HT，DA等的表達(dá)。ILF-TMS可引起腦內(nèi)微環(huán)境的變化，而微環(huán)境則是影響eNSCs的重要因素。ILF-TMS的連續(xù)磁場可在腦區(qū)產(chǎn)生超低頻電流，進(jìn)

6、而模擬多種神經(jīng)遞質(zhì)的慢突觸后電位的作用。施加的ILF-TMS頻率不同，可分別影響興奮性神經(jīng)遞質(zhì)和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)。我們前期的實(shí)驗(yàn)提示，對(duì)大腦中動(dòng)脈缺血再灌注(MCAO)損傷大鼠給予11 mHz ILF-TMS治療后，通過免疫組織化學(xué)染色檢測海馬區(qū)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)及巢蛋白(nestin)的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與假刺激組比較，ILF-TMS治療組大鼠內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞(endogenous Neural stem cell

7、s，eNSCs)得到持續(xù)的激活，BrdU及nestin得到更多的表達(dá)，且18分制神經(jīng)功能障礙評(píng)分更高。
　　目的：
　　本實(shí)驗(yàn)通過進(jìn)一步觀察ILF-TMS干預(yù)后對(duì)局部腦缺血再灌注大鼠7天、14天、21天及28天4個(gè)不同時(shí)相海馬區(qū)齒狀回顆粒下層(subgranularzone，SGZ)及顆粒細(xì)胞層(granule cell layer，GCL)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖、遷移及分化的影響，并采用mNSS神經(jīng)功能障礙評(píng)分方法對(duì)各組大鼠

8、進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)定，試圖探討ILF-TMS在缺血性腦卒中海馬齒狀回神經(jīng)損傷修復(fù)過程中的作用機(jī)制，為ILF-TMS應(yīng)用于臨床腦卒中患者的治療提供更充分的理論依據(jù)。
　　方法：
　　1、參照Longa等的線栓法建立大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈栓塞缺血再灌注損傷模型(MCAO)。將造模成功的大鼠隨機(jī)分配到ILF-TMS7天組、ILF-TMS14天組、ILF-TMS21天組、ILF-TMS28天組及假刺激7天組、假刺激14天組、假刺激21天組、

9、假刺激28天組;同時(shí)設(shè)立假手術(shù)7天組、假手術(shù)14天組、假手術(shù)21天組及假手術(shù)28天組。2、對(duì)ILF-TMS組大鼠給予刺激頻率為11 mHz，場強(qiáng)均為500 Gs的超低頻經(jīng)顱磁刺激，每次30 min，1次/天;假刺激組大鼠同樣放置磁刺激儀內(nèi)固定，但不進(jìn)行超低頻經(jīng)顱磁刺激，余處理同ILF-TMS組大鼠;假手術(shù)組大鼠自然飼養(yǎng)。3、各組大鼠在處死前24小時(shí)腹腔注射Brdu，每次間隔4小時(shí)，共3次。末次注射12h后處死動(dòng)物取材。4、分別在第7天、

10、第14天、第21天及28天應(yīng)用改良神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分方法(mNSS)對(duì)各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)定。5、將評(píng)分后的大鼠處死后取腦，置于4％多聚甲醛中后固定過夜，之后石蠟包埋，行連續(xù)冠狀位切片。通過蘇木精-伊紅染色法（HE染色）觀察缺血組織病理形態(tài)，免疫熒光染色檢測缺血后7天、14天、21天與28天4個(gè)不同時(shí)相海馬區(qū)齒狀回顆粒下層(SGZ)及顆粒細(xì)胞層(GCL)BrdU+、PSA-NCAM+、NeuN+、GFAP+表達(dá)的變化。采用Image

11、-Pro Plus軟件進(jìn)行圖形分析，計(jì)算每平方毫米的陽性細(xì)胞數(shù)。
　　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：
　　應(yīng)用spss19.0版統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示（(x)±s），多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1、各時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組大鼠活動(dòng)情況較好，與ILF-TMS組大鼠及假刺激組大鼠比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。第14天、21天及28天3

12、個(gè)時(shí)間點(diǎn)，ILF-TMS組較假刺激組大鼠mNSS評(píng)分降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。ILF-TMS組及假刺激組大鼠mNSS評(píng)分隨時(shí)間的延長而逐漸降低，組內(nèi)任意兩時(shí)間點(diǎn)之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)
　　2、病理學(xué)觀察HE染色光鏡下可見假手術(shù)組大腦皮質(zhì)及海馬區(qū)細(xì)胞排列整齊，組織結(jié)構(gòu)完整。局部缺血再灌注后，大鼠右側(cè)大腦皮質(zhì)可見缺血灶，細(xì)胞變性壞死。海馬區(qū)細(xì)胞排列紊亂，部分細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清，可見核固縮，核仁消失。ILF-TMS

13、組大鼠腦組織上述病理改變較假刺激組減輕，細(xì)胞存活數(shù)量較假手術(shù)組多，神經(jīng)細(xì)胞排列基本規(guī)整。存活細(xì)胞大小及形態(tài)基本正常，核仁清晰，胞漿藍(lán)染。
　　3、海馬齒狀回BrdU+細(xì)胞數(shù)表達(dá)的變化:各組大鼠海馬齒狀回均有BrdU+細(xì)胞分布。在7天、14天、21天、28天4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，局部缺血再灌注大鼠海馬齒狀回BrdU+細(xì)胞數(shù)均高于假手術(shù)組（均P＜0.05）。而在局部缺血再灌注后同一時(shí)相，ILF-TMS組大鼠海馬齒狀回BrdU+細(xì)胞數(shù)均高于假刺激

14、組（均P＜0.05）。
　　4、海馬齒狀回BrdU+/PSA-NCAM+細(xì)胞表達(dá)的變化:假手術(shù)組海馬齒狀回僅能觀察到少量BrdU+/PSA-NCAM+細(xì)胞。同一時(shí)間點(diǎn)，局部缺血再灌注大鼠BrdU+/PSA-NCAM+細(xì)胞數(shù)均高于假手術(shù)組（均P＜0.05）。而在局部缺血再灌注14天后，ILF-TMS組大鼠海馬齒狀回BrdU+/PSA-NCAM+細(xì)胞數(shù)高于假刺激組（均P＜0.05）。
　　5、海馬齒狀回BrdU+/NeuN+細(xì)胞

15、表達(dá)的變化:假手術(shù)組海馬齒狀回僅能觀察到少量BrdU+/NeuN+細(xì)胞。在第7天后，局部缺血再灌注大鼠BrdU+/NeuN+細(xì)胞數(shù)均高于假手術(shù)組(P＜0.05)。在SGZ區(qū)，不同時(shí)間點(diǎn)ILF-TMS組BrdU+/NeuN+細(xì)胞數(shù)與假刺激組比較無顯著差異(均P＞0.05)。在GCL區(qū)，21天及28天ILF-TMS組BrdU+/NeuN+細(xì)胞數(shù)較假刺激組顯著增多(P＜0.05)。
　　6、海馬齒狀回BrdU+/GFAP+細(xì)胞表達(dá)的變化

16、:假手術(shù)組海馬齒狀回僅能觀察到少量BrdU+/GFAP+細(xì)胞。在14天后，局部缺血再灌注大鼠BrdU+/GFAP+細(xì)胞數(shù)均高于假手術(shù)組（均P＜0.05）。在SGZ區(qū)，14天后，假刺激組BrdU+/GFAP+胞數(shù)較ILF-TMS組增多(P＜0.05)。在GCL區(qū)，21天及28天假刺激組BrdU+/GFAP+細(xì)胞數(shù)較ILF-TMS顯著增多(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、大腦中動(dòng)脈缺血再灌注損傷可引起大鼠海馬區(qū)內(nèi)源性神經(jīng)干