電刺激小腦頂核（FNS）對大鼠局灶腦缺血-再灌注后腦內(nèi)成體神經(jīng)干細(xì)胞增殖、遷移的影響.pdf

1、背景腦血管病以其高發(fā)病率和高致殘率成為當(dāng)前嚴(yán)重威脅人類健康的一類重要疾病，其中以缺血性腦血管病為最常見。大腦中動(dòng)脈閉塞(middlecerebralarteryocclusion，MCAO)是缺血性腦血管病中最常見的一種，治療的關(guān)鍵在于挽救缺血半暗帶瀕臨死亡的神經(jīng)元和促進(jìn)損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)，但目前在臨床上能得到普遍公認(rèn)的治療方法相當(dāng)缺乏，且絕大多數(shù)藥物的I臨床療效均不理想。神經(jīng)干細(xì)胞(neuralstemcell，NSC)的發(fā)現(xiàn)并體外

2、培養(yǎng)成功，為中樞神經(jīng)系統(tǒng)(centralnervoussystem，CNS)功能重建和神經(jīng)再生提供了新的思路。目前已公認(rèn)的兩個(gè)神經(jīng)發(fā)生(neurogenesis)區(qū)域?yàn)閭?cè)腦室外側(cè)壁的腦室下區(qū)(subventricularzone，SVZ)和海馬齒狀回(dentategyrus，DG)的顆粒下層(subgranularlayer，SGL)，另外在哺乳動(dòng)物的脊髓、隔區(qū)、紋狀體也分離出了神經(jīng)干細(xì)胞。這預(yù)示著神經(jīng)干細(xì)胞廣泛存在于成年哺乳動(dòng)物的中

3、樞神經(jīng)系統(tǒng)，能不斷地產(chǎn)生新的神經(jīng)元與膠質(zhì)細(xì)胞，為治療和治愈腦缺血提供了可能。 成年腦內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞在正常情況下大多處于靜息狀態(tài)，只有在某些因素作用下或者受到損傷刺激時(shí)，神經(jīng)干細(xì)胞才被激活，重新進(jìn)入細(xì)胞增殖周期，在趨化因子的作用下向損傷部位遷移，并進(jìn)一步分化為特定功能的神經(jīng)細(xì)胞。研究表明，神經(jīng)干細(xì)胞的生存與其所在的“小生境(niche)”密切相關(guān)，神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)遞質(zhì)、細(xì)胞黏附分子和趨化因子等許多因素都參與了神經(jīng)再生過程。

4、 近十多年來，國內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)電刺激小腦頂核(fastigialnucleusstimulation，F(xiàn)NS)可產(chǎn)生廣泛的神經(jīng)保護(hù)作用，由此引出了“條件性中樞神經(jīng)源性神經(jīng)保護(hù)(conditionedcentralneurogenicneuroprotection，CCNN)"的概念；并圍繞CCNN保護(hù)機(jī)制進(jìn)行了一系列研究，尤其借助于經(jīng)典的神經(jīng)生理學(xué)方法、神經(jīng)核團(tuán)毀損術(shù)、神經(jīng)纖維示蹤術(shù)，結(jié)合現(xiàn)代分子生物學(xué)、免疫組織化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)等技

5、術(shù)，研究取得了重要的成果。臨床觀察到，‘‘電刺激小腦頂核(FNS)"治療后，腦卒中患者已損失的神經(jīng)功能部分恢復(fù)，是否與內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的激活有關(guān)，目前尚無這方面報(bào)道?；谏鲜隼碛桑菊n題將著重研究局灶缺血／再灌注后及電刺激小腦頂核(FNS)干預(yù)下側(cè)腦室室下帶(SVZ)、海馬齒狀回(DG)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、遷移，初步探討FNS在腦組織重建中的作用和地位及利用內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行“補(bǔ)充治療”的細(xì)胞和分子機(jī)制。 目的(1)研究成年大鼠

6、局灶腦缺血／再灌注及電刺激小腦頂核(FNS)后缺血側(cè)側(cè)腦室和海馬的成體神經(jīng)干細(xì)胞增殖情況；(2)初步明確成年大鼠局灶腦缺血／再灌注及電刺激小腦頂核(FNS)后缺血側(cè)側(cè)腦室和海馬成體神經(jīng)干細(xì)胞遷移的軌跡；(3)了解成年大鼠局灶腦缺血／再灌注后及電刺激小腦項(xiàng)核(FNS)后缺血側(cè)側(cè)腦室和海馬bFGFmRNA、BDNFmRNA的表達(dá)水平，以了解神經(jīng)干細(xì)胞增殖的機(jī)制。 方法雄性Wistar大鼠180只，通過改良線栓法制備大腦中動(dòng)脈局灶腦缺

7、血1h/再灌注模型，隨機(jī)分為正常對照組(NC組)，假手術(shù)組(SC組)，單純?nèi)毖俟嘧⒔M(I／R組)，缺gn／再灌注+小腦頂核假刺激組(I／RFs組)，缺血／再灌注+小腦項(xiàng)核刺激(I／RF)組。根據(jù)再灌注時(shí)間的不同又分為1d、3d、7d、14d、21d、28d6個(gè)亞組，每個(gè)亞組動(dòng)物數(shù)n=6只。在ld、2d、6d、13d、20d、27d時(shí)腹腔注射Brdu來標(biāo)記增殖的細(xì)胞。根據(jù)Wistar大鼠腦立體定向圖譜結(jié)合鼠的大小確定小腦頂核的適當(dāng)位置

8、，用三通道電子刺激器于局灶腦缺血1h/再灌注后立即作連續(xù)刺激，刺激時(shí)間為1h。 通過TTC染色和HE染色來了解局灶腦缺血／再灌注后腦組織的病理學(xué)變化；通過免疫組化動(dòng)態(tài)檢測側(cè)腦室和海馬區(qū)域Brdu陽性細(xì)胞和Nestin陽性細(xì)胞隨時(shí)間點(diǎn)和干預(yù)手段不同的表達(dá)變化；通過原位雜交動(dòng)態(tài)檢測側(cè)腦室和海馬區(qū)域bFGFmRNA、BDNFmRNA隨時(shí)間點(diǎn)和干預(yù)手段不同的表達(dá)變化，加深對神經(jīng)發(fā)生機(jī)制的理解。通過顯微圖像分析系統(tǒng)對陽性結(jié)果進(jìn)行分析。

9、 結(jié)果(1)電刺激小腦項(xiàng)核(FNS)使腦梗塞灶體積明顯減小。(2)Brdu免疫組化結(jié)果：NC組和SC組側(cè)腦室和海馬區(qū)只存在少量Brdu陽性細(xì)胞，局灶腦缺血／再灌注后缺血側(cè)側(cè)腦室和海馬區(qū)Brdu陽性細(xì)胞呈現(xiàn)出單峰變化趨勢，即1d時(shí)開始增加(P<0．05)，3d時(shí)增加明顯(P<0．01)，到7d達(dá)一小峰值(P<0．01)，14d后迅速下降(P<0．01)，28d時(shí)已明顯下降(P<0．05)；FN假刺激組(I／RFs組)與I／R組變化相似

10、，各對應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較差異無顯著性(P>0．05)；而局灶腦缺血／再灌注后再給予FNS(I／RF組)，上述兩個(gè)區(qū)域Brdu陽性細(xì)胞增殖更加明顯，1d時(shí)開始增加(P<0．05)，3d時(shí)明顯增加(P<0．01)，7d達(dá)峰值(P<0．01)，峰值更高，14d后緩慢下降(P<0．01)，28d時(shí)已明顯下降(P<0．05)，與NC組和SC組各對應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較，差異有極顯著性(P<0．01)，與UR組和I／RFS組在1d、3d、7d、14d時(shí)間點(diǎn)比較，差

11、異有極顯著性(P<0．01)，在21d、28d時(shí)間點(diǎn)比較，差異有顯著性(P<0．05)。局灶腦缺血／再灌注還誘發(fā)Brdu陽性細(xì)胞發(fā)生遷移，而FNS后Brdu陽性細(xì)胞遷移更加明顯，細(xì)胞更稠密，距離更遠(yuǎn)，形成長尾狀陽性細(xì)胞鏈，同時(shí)缺血紋狀體內(nèi)Brdu陽性細(xì)胞逐漸增多。(2)Nestin免疫組化結(jié)果：NC組和SC組側(cè)腦室和海馬區(qū)只存在少量Nestin陽性細(xì)胞，局灶腦缺血／再灌注后缺血側(cè)側(cè)腦室和海馬區(qū)Nestin陽性細(xì)胞也呈現(xiàn)出單峰變化趨勢，即

12、1d時(shí)開始增加(P<0．05)，3d時(shí)增加明顯(P<0．01)，到7d達(dá)峰值(P<0．01)，14d后迅速下降(P<0．01)，28d時(shí)已明顯下降(P<0．05)；I／RFs組與I／R組變化相似，各對應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較差異無顯著性(P>0．05)；而局灶腦缺血／再灌注后再給予FNS，上述兩個(gè)區(qū)域Nestin陽性細(xì)胞增殖更加明顯，1d時(shí)開始增加(P<0．05)，3d時(shí)增加明顯(P<0．01)，7d達(dá)峰值(P<0．01)，峰值更高，14d后緩慢下

13、降(P<0．01)，28d時(shí)已明顯下降(P<0．05)，與NC組和SC組各對應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較，差異有極顯著性(P<0．01)，與I／R組和I／RFs組在1d、3d、7d、14d時(shí)間點(diǎn)比較，差異有極顯著性(P<0．01)，在2ld、28d時(shí)間點(diǎn)比較，差異有顯著性(P<0．05)。(3)bFGFmRNA原位雜交結(jié)果：正常腦組織中bFGFmRNA表達(dá)廣泛，但表達(dá)較弱；局灶腦缺血／再灌注后，缺血側(cè)側(cè)腦室和海馬區(qū)均可見bFGFmRNA的陽性表達(dá)增加(

14、P<0．05)，3d時(shí)明顯增加(P<0．01)，7d達(dá)一小高峰(P<0．01)，14d后迅速下降，28d時(shí)已明顯下降，略高于正常水平(P<0．05)；而局灶腦缺血／再灌注后再給予FNS，1d時(shí)bFGFmRNA~口明顯增加(P<0．01)，3d時(shí)增加更明顯(P

15、降，略高于I／R組和I／RFs組(P

16、5)；局灶腦缺血／再灌注后再給予FNS，ld時(shí)即明顯增加(P<0．01)，3d時(shí)增加更明顯(P<0．01)，7d達(dá)到高峰(P<0．01)，維持到14d(紋狀體區(qū)14d較7dP>0．05)，然后逐漸緩慢下降，21d時(shí)仍明顯高于其余各組(P<0．01)，28d時(shí)明顯下降，略高于I／R組和I／RFs組(P<0．05)，但仍明顯高于正常水平(P<0．01)。 結(jié)論(1)電刺激小腦頂核(FNS)能使梗塞灶體積減小；(2)局灶缺血／再灌注可

17、激活成體腦內(nèi)側(cè)腦室和海馬區(qū)域的神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)生增殖、遷移；(3)電刺激小腦頂核(FNS)能使局灶腦缺血／再灌注后成體腦內(nèi)側(cè)腦室和海馬區(qū)域的神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)生增殖更加明顯；(4)電刺激小腦頂核(FNS)能促進(jìn)局灶腦缺血／再灌注后成體腦內(nèi)側(cè)腦室和海馬區(qū)域的神經(jīng)干細(xì)胞遷移數(shù)量更多，遷移的距離更長；(5)局灶腦缺血／再灌注可誘導(dǎo)成體腦內(nèi)bFGFmRNA、BDNFmRNA反應(yīng)增加、表達(dá)增高，但表達(dá)時(shí)程較短暫；(6)電刺激小腦項(xiàng)核(FNS)能使局灶腦缺血