電刺激小腦頂核對大鼠局灶腦缺血-再灌注后腦內(nèi)成體神經(jīng)干細胞增殖分化的影響及其作用機制的研究.pdf

1、缺血性腦卒中是神經(jīng)系統(tǒng)的常見病和多發(fā)病，在腦卒中約占75％。大多數(shù)患者中遺留有癱瘓、失語等嚴重后遺癥，給患者帶來極大的痛苦，同時也給社會和家庭帶來沉重的負擔。腦缺血/再灌注損傷使腦組織的功能障礙和結構損傷更加嚴重，使治療效果大大降低。因此如何采取合理的措施預防和治療缺血性腦血管病，恢復受損神經(jīng)細胞功能，降低致殘率和病死率，近年來已成為醫(yī)學界關注的熱點課題。腦缺血/再灌注損傷是一復雜的病理生理過程，神經(jīng)元結構破壞和缺失可能是引起功能障礙的

2、病理關鍵。目前還沒有理想的治療腦缺血/再灌注損傷的方法。研究發(fā)現(xiàn)電刺激小腦頂核對神經(jīng)系統(tǒng)疾病有神經(jīng)保護作用，可以抗炎癥、抑制細胞凋亡、促進神經(jīng)組織的結構重建等作用。目前，采用仿生物電，模擬實驗性小腦頂核電刺激而研制的小腦電刺激儀已廣泛應用于許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床治療，對多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病都產(chǎn)生了比較肯定的臨床效果。Notch1是控制細胞命運的信號傳導途徑。當Notch1被激活后，神經(jīng)干細胞進行增殖，而當Notch1活性被抑制時，干細胞

3、則進入分化程序。bHLH基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子（包括Hes5和Mash1）是指由一個堿性螺旋-環(huán)-螺旋結構及其上游富含堿性氨基酸序列的核酸順序組成的一類基因，可以調(diào)控許多基因的轉(zhuǎn)錄。研究表明，Hes5信號通路能抑制神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元方向分化，促進神經(jīng)干細胞增殖。Mash1的高表達可促進干細胞的分化，相反低表達則抑制干細胞的分化，使干細胞處于持續(xù)的增殖狀態(tài)。核轉(zhuǎn)錄因子-κB對神經(jīng)干細胞增殖分化作用機制十分復雜，通過對眾多涉及炎癥和免疫反應等方面

4、的基因調(diào)控來影響神經(jīng)干細胞增殖分化。基于以往實驗研究與臨床的成果，本實驗從電刺激小腦頂核干預局灶腦缺血/再灌注損傷內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的研究入手，進一步探討電刺激小腦頂核對大鼠局灶腦缺血/再灌注損傷腦組織神經(jīng)干細胞的增殖分化的影響及其作用機制，為缺血性腦血管病的治療提供實驗基礎。 目的: 1.觀察電刺激小腦頂核對大鼠局灶腦缺血/再灌注神經(jīng)行為學、神經(jīng)功能缺損的影響以及腦組織的含水量、腦梗死體積的變化。 2.觀察局灶腦

5、缺血/再灌注各時間點大鼠成體神經(jīng)干細胞的增殖分化及電刺激小腦頂核對局灶腦缺血/再灌注大鼠成體神經(jīng)干細胞的增殖分化的影響，探討電刺激小腦頂對局灶腦缺血/再灌注后神經(jīng)重建的作用。 3.觀察電刺激小腦頂核對大鼠局灶腦缺血/再灌注大鼠大腦缺血側(cè)皮質(zhì)Notch1、Hes5、Mash1和NF-κB p65 mRNA和蛋白表達的變化，進一步探討電刺激小腦頂核對大鼠局灶腦缺血/再灌注后腦內(nèi)成體神經(jīng)干細胞增殖分化影響的作用機制。 方法:

6、 1.改良線栓法制備大鼠大腦中動脈局灶腦缺血1.5h再灌注模型。成年SD大鼠隨機分為正常對照組（N組），假手術組（S組），缺血/再灌注組（I/R組），缺血/再灌注后小腦頂核假刺激組（SF組），缺血/再灌注后小腦頂核刺激（F）組。根據(jù)再灌注時間的不同又分為1d、3d、7d3個亞組。對大鼠進行神經(jīng)功能缺損評分以及測量腦組織的含水量、腦梗死體積的變化。 2.制備大腦中動脈局灶腦缺血1.5h再灌注模型。成年SD大鼠隨機分為正常對照

7、組（N組），假手術組（S組），缺血/再灌注組（I/R組），缺血/再灌注后小腦頂核刺激（F）組。根據(jù)再灌注時間的不同又分為3d、7d、14d、28d4個亞組，每個亞組動物數(shù)n=7只。免疫熒光單標和雙標法檢測研究局灶腦缺血/再灌注及電刺激小腦頂核對缺血/再灌注大鼠神經(jīng)干細胞的增殖的動態(tài)變化和分化的結果。 3.改良線栓法制備大腦中動脈局灶腦缺血1.5h再灌注模型。成年SD大鼠隨機分為假手術組（S組），缺血/再灌注組（I/R組），缺血/

8、再灌注后小腦頂核刺激（F）組。根據(jù)再灌注時間的不同又分為14d、28d2個亞組，每個亞組動物數(shù)n=7只。采用RT-PCR和Western blotting檢測局灶腦缺血/再灌注及電刺激小腦頂核對大鼠局灶腦缺血/再灌注后Notch1、Hes5和Mash1 mRNA及蛋白的表達，采用RT-PCR和免疫組化技術檢測NF-κB p65 mRNA及蛋白的表達。 結果: 1.電刺激小腦頂核能提高局灶腦缺血/再灌注大鼠的神經(jīng)功能缺損評

9、分，降低缺血側(cè)腦組織中腦含水量，縮小腦梗死體積。 2.正常對照組和假手術組側(cè)腦室區(qū)和缺血周圍皮質(zhì)只存在少量Brdu陽性細胞，局灶腦缺血/再灌注腦損傷后3d大鼠側(cè)腦室下區(qū)Brdu陽性細胞顯著增加（P<0.01），7d時增加達到頂鋒（P<0.01），14d和28d時后Brdu陽性細胞仍增加（P<0.01）；局灶腦缺血/再灌注腦損傷后3d大鼠缺血周圍皮質(zhì)Brdu陽性細胞也顯著增加（P<0.001），7d時增加達到頂峰（P<0.001）

10、，14d和28d時后Brdu陽性細胞仍顯著增加（P<0.001）；電刺激小腦頂核后大鼠側(cè)腦室下區(qū)和缺血周圍皮質(zhì)Brdu陽性細胞增加更明顯，與缺血/再灌注組比較，在3d、7d、14d和28d四個時間點Brdu陽性細胞增加更多，均有顯著性差異（P<0.05）。免疫熒光雙標法顯示在正常組、假手術組僅見極少量Brdu/GFAP和Brdu/DCX雙陽性細胞，缺血/再灌注組可見少量Brdu/GFAP和Brdu/DCX雙陽性細胞，小腦頂核刺激組可見大

11、量Brdu/GFAP和Brdu/DCX雙陽性細胞，Brdu/GFAP和Brdu/DCX雙陽性細胞明顯增多，主要分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞。 3.與假手術組比較，腦缺血/再灌注組和腦缺血/再灌注后小腦頂核刺激組Notch1、Hes5、Mash1 mRNA和蛋白的表達量均增加（P<0.01）；與腦缺血/再灌注組比較，小腦頂核刺激組Notch1、Hes5、Mash1 mRNA和蛋白的表達量增加更明顯（P<0.05）。與假手術組比較，腦

12、缺血/再灌注組和腦缺血/再灌注后小腦頂核刺激組NF-κB p65 mRNA和蛋白的表達量均增加（P<0.01）；與腦缺血/再灌注組比較，小腦頂核刺激組NF-κBp65 mRNA和蛋白的表達量明顯降低（P<0.05）。 結論: 1.成功建立改良線栓法大鼠局灶腦缺血/再灌注模型。電刺激小腦頂核可以降低腦缺血/再灌注損傷后急性期死亡率，促進肢體功能恢復。電刺激小腦頂核能提高大腦中動脈局灶腦缺血/再灌注模型大鼠的神經(jīng)功能缺損評分

13、，降低缺血側(cè)腦組織中腦含水量，縮小腦梗死體積，從而達到腦保護作用 2.腦缺血后自身的神經(jīng)干細胞也存在增殖。在正常對照組和假手術組大鼠SVZ和缺血側(cè)皮質(zhì)有少量神經(jīng)干細胞，未見神經(jīng)干細胞增殖。內(nèi)源性神經(jīng)干細胞增殖在腦缺血再灌注后逐漸升高，在腦梗死后7d達到高峰，以后增殖逐漸下降，28d神經(jīng)干細胞仍有增殖。電刺激小腦頂核后神經(jīng)干細胞增殖更明顯，在7d達到高峰，28d后在SVZ和缺血周圍皮質(zhì)神經(jīng)干細胞均還有明顯增殖。電刺激小腦頂核能促進

14、腦缺血后大鼠內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的增殖。在正常組、假手術組僅見極少量神經(jīng)干細胞分化，缺血/再灌注組可見少量神經(jīng)干細胞分化，小腦頂核刺激組可見大量神經(jīng)干細胞分化，分化明顯增多，分化為神經(jīng)膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元。電刺激小腦頂核促進神經(jīng)干細胞分化為神經(jīng)膠質(zhì)樣細胞和神經(jīng)元樣細胞。電刺激小腦頂核通過促進內(nèi)源性神經(jīng)干細胞增殖和分化發(fā)揮腦組織神經(jīng)重建作用。 3.正常成年大鼠腦組織Notch1、Hes5、Mash1和NF-κB p65表達較少。局灶腦缺血