電刺激小腦頂核誘導腦缺血大鼠未知miRNA的鑒定及功能分析.pdf

1、早期的研究發(fā)現(xiàn)電刺激小腦頂核(fastigial nucleus stimulation，F(xiàn)NS)能夠啟動內(nèi)源性神經(jīng)保護作用，減輕局灶性腦缺血損傷，但其機制及具體途徑仍未闡明。新發(fā)現(xiàn)的微小RNA(microRNA，miRNA)作為一類重要的內(nèi)源性分子，其參與調(diào)控基因表達的重要意義為FNS的神經(jīng)保護機制研究提供了新的思路。前期我們采用高通量測序及芯片技術(shù)對電刺激小腦頂核1h后腦缺血大鼠的腦組織進行miRNA的表達譜分析，提示差異表達的mi

2、RNA可能通過靶向調(diào)控相關(guān)基因在預電刺激小腦頂核的大鼠中發(fā)揮腦保護作用。本研究主要對這些未知的miRNA序列進行鑒定和分析，并初步探索其在腦缺血神經(jīng)保護中的功能及其作用機制。
　　第一部分 電刺激小腦頂核誘導腦缺血大鼠未知miRNA的鑒定
　　目的：分析深度測序獲得的電刺激小腦頂核誘導腦缺血大鼠的未知miRNA序列，以篩選結(jié)構(gòu)典型、具有高度保守性的真正的miRNA。
　　方法：利用生物信息學方法，對前期深度測序獲得的原

3、始序列數(shù)據(jù)進行分類注釋，根據(jù)miRNA的典型結(jié)構(gòu)特性及物種保守性篩選候選的新的miRNA;利用實時定量PCR的方法對新的miRNA進行表達驗證。
　　結(jié)果：經(jīng)比對，共鑒定出781個與哺乳類物種同源的未知的miRNA成熟序列。通過進一步的生物學特征分析，我們鑒定出一個新的miRNA(PC-3p-3469_406)，結(jié)合miRNA的保守性特征，我們將其暫命名為rno-miR-676-1。RT-PCR證實這個新的miR-676-1在肌肉

4、和腦組織的表達量最高。
　　結(jié)論：rno-miR-676-1（PC-3p-3469_406）是結(jié)構(gòu)典型、進化上具有保守性的新的miRNA。
　　第二部分 rno-miR-676-1在預電刺激小腦頂核后缺血再灌注損傷中的作用
　　目的：探討mo-miR-676-1在預電刺激小腦頂核后大鼠腦缺血再灌注損傷中的神經(jīng)保護作用機制。
　　方法：(1)將SD雄性大鼠隨機分3組:①假手術(shù)組;②單純腦缺血組;③預電刺激組;RT-

5、PCR檢測rno-miR-676-1在電刺激小腦頂核后局灶性腦缺血大鼠的差異表達情況。(2)通過側(cè)腦室注射rno-miR-676-1的類似物或抑制物進行體內(nèi)的過表達和抑制表達實驗，動物行為學評估神經(jīng)功能缺損情況、TTC染色測定梗死體積、TUNEL染色檢測細胞凋亡指數(shù)，探討rno-miR-676-1在缺血損傷中的生物學功能。(3)生物信息軟件預測rno-miR-676-1的靶基因，雙熒光素酶報告系統(tǒng)基因檢測系統(tǒng)驗證rno-miR-676-

6、1與靶基因的相互作用關(guān)系。
　　結(jié)果：(1)與單純腦缺血再灌注損傷的大鼠相比，電刺激小腦頂核后腦缺血大鼠的rno-miR-676-1表達上調(diào)。(2) rno-miR-676-1上調(diào)后，腦缺血大鼠的神經(jīng)功能缺損癥狀減輕、梗死體積減小、神經(jīng)元凋亡指數(shù)降低;而rno-miR-676-1表達下調(diào)后腦缺血大鼠的神經(jīng)功能缺損癥狀加重、梗死體積增大、神經(jīng)元凋亡指數(shù)升高。(3)軟件預測AUP1、CCNJ、PDPK1、BCL2L2和HRAS是rno