芒柄花黃素在骨肉瘤增殖凋亡中的作用及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景:骨肉瘤，是骨腫瘤中最為常見的一種惡性腫瘤。主要發(fā)病于10-25歲的青少年患者，男性多于女性。其好發(fā)年齡為青春期，此時(shí)期體內(nèi)性激素水平最為活躍，人體生長最為旺盛，這提示該疾病可能與人體內(nèi)雌激素水平及相應(yīng)受體表達(dá)異常有密切關(guān)系。傳統(tǒng)的治療方法為單純的截肢手術(shù)，治療效果極差，致殘率高，5年生存率低。骨肉瘤極早期即發(fā)生血行轉(zhuǎn)移，肺部轉(zhuǎn)移是骨肉瘤患者最主要的致死原因。目前控制骨肉瘤肺部轉(zhuǎn)移最關(guān)鍵的臨床治療手段是化療。然而，化療過程中經(jīng)常

2、出現(xiàn)的嚴(yán)重毒副反應(yīng)，嚴(yán)重影響化療的進(jìn)行，因此使用傳統(tǒng)的化療等治療方案也很難達(dá)到令人滿意的臨床效果。
　　雌激素由卵泡和胎盤產(chǎn)生，腎上腺及雄性的睪丸也可以產(chǎn)生少量雌激素，促進(jìn)女性生殖系統(tǒng)發(fā)育，是人體內(nèi)一種重要的性激素。雌激素受體(ER)是一類由配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，是核受體超家族成員之一。雌激素通過與靶器官的雌激素受體結(jié)合而發(fā)揮其功能。大量的臨床及實(shí)驗(yàn)研究表明，雌激素受體在骨肉瘤病例中存在表達(dá)，包括ERα及ERβ受體，提示骨肉瘤可能是

3、激素依賴性腫瘤。
　　內(nèi)分泌治療是近年興起的治療腫瘤的綜合手段之一。內(nèi)分泌治療通過抑制相應(yīng)的激素合成、降低激素釋放水平、降低激素及其受體活性、阻斷激素與其相應(yīng)受體的結(jié)合等多種途徑，達(dá)到抑制激素依賴性腫瘤的發(fā)生及腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，減弱腫瘤細(xì)胞侵襲力及轉(zhuǎn)移，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。因激素本身是體內(nèi)存在的正常成分，因此內(nèi)分泌治療的最大優(yōu)點(diǎn)在于毒副作用小、效應(yīng)持久且作用于全身，對有腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者同樣有很好的療效。本研究通

4、過對植物雌激素芒柄花黃素對骨肉瘤這一激素依賴性腫瘤的作用效果的觀察，初步探討雌激素在骨肉瘤中可能扮演的作用，為骨肉瘤的的內(nèi)分泌治療及預(yù)后判斷提供一定的參考依據(jù)。
　　目的:
　　1.通過體外實(shí)驗(yàn)，研究植物雌激素芒柄花黃素對骨肉瘤U2OS細(xì)胞增殖凋亡的作用；
　　2.通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，研究芒柄花黃素對裸鼠骨肉瘤移植瘤的抑制作用及藥物對裸鼠的毒副作用；
　　3.明確可能參與芒柄花黃素對骨肉瘤抗腫瘤效應(yīng)的作用機(jī)制。

5、　　方法:
　　1.選用人骨肉瘤U2OS細(xì)胞株，用不同濃度的芒柄花黃素(0，20，40及80μM)干預(yù)細(xì)胞，采用MTT法、流式細(xì)胞術(shù)等方法，檢測芒柄花黃素對骨肉瘤U2OS細(xì)胞抑制增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面的影響；在流式細(xì)胞儀（FA CSCalibur）上分析熒光強(qiáng)度，定量檢測細(xì)胞周期中G0-G1、S、和 G2-M期所占百分比。Hoechst33258染色法觀察細(xì)胞形態(tài)。采用蛋白免疫印跡、Real-time PCR等方法，檢測芒柄花黃素

6、調(diào)控骨肉瘤U2OS細(xì)胞Bcl-2、Bax及miR-375的表達(dá)情況。
　　2.建立裸鼠荷人骨肉瘤U2OS細(xì)胞移植瘤動物模型，用不同濃度的芒柄花黃素(0，20，40及80μM)干預(yù)腫瘤生長，觀察芒柄花黃素對腫瘤體積、重量的抑制率，藥物的毒副作用；采用腫瘤組織切片HE染色及免疫組化法，觀察腫瘤組織中Bcl-2、Bax的表達(dá)情況；采用蛋白免疫印跡、Real-time PCR檢測芒柄花黃素調(diào)控腫瘤組織中Bcl-2、Bax及miR-375的

7、表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1. MTT結(jié)果顯示，芒柄花黃素對骨肉瘤U2OS細(xì)胞增殖有明顯抑制作用，并呈劑量和時(shí)間依賴性。經(jīng)的芒柄花黃素處理后72小時(shí)后，其生長抑制率可達(dá)到71％。在細(xì)胞周期中，G0/G1期的分布比例較高，在G0/G1期的分布比例隨芒柄花黃素濃度的提高而逐漸增加。80μM
　　2.流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，芒柄花黃素有著明顯誘導(dǎo)骨肉瘤U2OS細(xì)胞凋亡的作用。經(jīng)40，80μM的芒柄花黃素處理后，其細(xì)胞凋亡率分別

8、為23%，34%。效應(yīng)呈濃度和時(shí)間依賴性。
　　3. Hoechst33258染色顯示：隨著芒柄花黃素藥物濃度升高，其對U2OS誘導(dǎo)凋亡的效果越明顯，細(xì)胞凋亡率越高，且呈濃度依賴性。
　　4. Western blot及Real-time PCR結(jié)果顯示：芒柄花黃素可上調(diào)骨肉瘤U2OS細(xì)胞Bax的表達(dá)及下調(diào)B cl-2及miR-375的表達(dá)，且呈濃度依賴效應(yīng)。
　　5.芒柄花黃素對裸鼠移植瘤的有明顯的抑瘤作用，80μM

9、的芒柄花黃素處理對腫瘤體積抑制率為41.12%，重量抑制率為39.53%。藥物對裸鼠的一般情況及肝腎功能未見明顯毒副作用。
　　6.腫瘤組織切片及免疫組化法結(jié)果，Bcl-2陽性表達(dá)隨芒柄花黃素干預(yù)濃度增加而減弱；而Bax陽性則隨芒柄花黃素干預(yù)濃度增加而增強(qiáng)。
　　7. Western blot及Real-time PCR法檢測結(jié)果顯示，腫瘤組織中，隨著芒柄花黃素濃度由逐漸提高，Bcl-2及miR-375表達(dá)量進(jìn)行性減低，Ba

10、x的表達(dá)進(jìn)行性增高。
　　結(jié)論:
　　1.芒柄花黃素對骨肉瘤U2OS細(xì)胞增殖有明顯抑制作用，并呈濃度和時(shí)間依賴性，主要可能是通過促進(jìn)G0/G1期細(xì)胞阻滯實(shí)現(xiàn)的。
　　2.芒柄花黃素對骨肉瘤U2OS細(xì)胞有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，并呈濃度和時(shí)間依賴性。隨著芒柄花黃素藥物濃度升高，U2OS細(xì)胞凋亡率越明顯。
　　3.芒柄花黃素對裸鼠移植瘤的體積、重量均有明顯的抑制作用，且呈濃度依賴效應(yīng)。
　　4.芒柄花黃素對裸鼠的生