蛋白質(zhì)組學(xué)及相關(guān)分析技術(shù)研究曲馬多誘導(dǎo)斑馬魚腦氧化應(yīng)激和依賴性潛力的關(guān)鍵蛋白質(zhì).pdf

1、鹽酸曲馬多(Tramadol hydrochloride，TH)作為一種非麻醉性中樞鎮(zhèn)痛藥，已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)最廣泛使用的處方藥。關(guān)于曲馬多在脊椎動(dòng)物中的積極作用的報(bào)導(dǎo)曾經(jīng)一直占據(jù)主導(dǎo)地位，包括緩解中度至重度疼痛、抗抑郁、抗炎和免疫刺激作用、排尿控制、降低糖尿病癥體內(nèi)的血糖濃度等。然而，近年來(lái)曲馬多濫用中毒、不良反應(yīng)和依賴性的市場(chǎng)監(jiān)測(cè)報(bào)告和臨床案例卻日益增多，而濫用相關(guān)的神經(jīng)毒性、功能障礙和依賴性潛力的細(xì)胞和分子水平機(jī)理的研究報(bào)道卻極少

2、。因而，迫切需要從分子和細(xì)胞水平對(duì)曲馬多濫用可能造成的依賴性潛力和神經(jīng)毒性等進(jìn)行微觀分析。 本論文選用斑馬魚(Danio rerio)為研究對(duì)象，從行為學(xué)角度觀察和統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，曲馬多急性處理增加魚對(duì)氧的需求量和對(duì)富氧的水體表層的偏好性，從而顯著增大表層的魚平均分布密度。與毒麻類強(qiáng)鎮(zhèn)痛藥-杜冷丁陽(yáng)性對(duì)照組相比同樣存在顯著差異，曲馬多處理組的這些異?，F(xiàn)象不僅出現(xiàn)的更迅速，且持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)(整個(gè)過(guò)程長(zhǎng)達(dá)6h)，并伴隨著魚運(yùn)動(dòng)活力的下降，屬

3、于斑馬魚對(duì)曲馬多特有的異常行為和生理反應(yīng)。含曲馬多飼料的長(zhǎng)期投喂，則會(huì)造成斑馬魚體重和腦重量平均值的下降。這些獨(dú)特異常的生理反應(yīng)，使斑馬魚成為研究曲馬多藥物毒性和藥物依賴性分子機(jī)理理想的動(dòng)物模型。 與其他阿片類藥物類似，曲馬多引起SOD酶活力下降和脂質(zhì)過(guò)氧化物含量的增加，表現(xiàn)出氧化強(qiáng)化劑特性；而慢性誘導(dǎo)過(guò)程中的抗氧化酶活性變化規(guī)律表明，斑馬魚對(duì)曲馬多的氧化毒性產(chǎn)生一定的適應(yīng)性和耐受性。氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析技術(shù)(GC/MS)跟蹤檢

4、測(cè)，單劑量肌注給藥后的魚腦、眼、鰓、心、肝、腸、肌等7種組織中曲馬多分布和清除情況；而繪制的原藥含量隨時(shí)間變化趨勢(shì)圖則顯示出，曲馬多在魚腦內(nèi)經(jīng)歷了一個(gè)快速分布和緩慢清除的過(guò)程。進(jìn)一步從魚腦組織中檢測(cè)出兩種主要去甲基代謝物，即O-去甲基曲馬多(M1)和N-去甲基曲馬多(M2)，其中M2的含量明顯高于M1，為主要去甲基代謝物。因而肌注給藥途徑和GC/MS分析技術(shù)，適合于研究曲馬多在魚體內(nèi)的分布、清除、代謝和藥效，尤其是神經(jīng)毒性機(jī)理；進(jìn)一步結(jié)

5、合SOD酶活性和MDA含量測(cè)定結(jié)果，即可以評(píng)估腦組織氧化應(yīng)激程度，還可以為合適的給藥劑量的選擇和后續(xù)的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選和鑒定關(guān)鍵蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)樣品的準(zhǔn)備提供科學(xué)的參考價(jià)值。 蛋白質(zhì)組學(xué)是目前從組織器官中篩選與鑒定差異蛋白質(zhì)的最佳分析技術(shù)之一。作者建立了一套適用于篩選和鑒定斑馬魚腦組織中的差異蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究方案。尤其是半定量雙向凝膠電泳技術(shù)的建立和質(zhì)譜鑒定前的樣品準(zhǔn)備中人血清轉(zhuǎn)鐵蛋白、白蛋白、鐵蛋白等蛋白添加劑或石蠟油、甘

6、油、凡士林等黏合劑作為肽質(zhì)量指紋質(zhì)譜鑒定的輔助增強(qiáng)劑的發(fā)現(xiàn)，都有效地提高了差異蛋白鑒定的靈敏度和可信度。曲馬多誘導(dǎo)差異表達(dá)的30個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)經(jīng)鑒定后，歸為13種蛋白，其中14-3-3蛋白、肌酸激酶(CK BB)、ATP合成酶(H+轉(zhuǎn)運(yùn)，線粒體F1復(fù)合體，beta亞基)和微管蛋白等在不同的凝膠位置，分別檢出3、3、4和11種亞型；按蛋白功能分為六大類：細(xì)胞骨架、能量代謝、信號(hào)傳導(dǎo)、突觸功能、蛋白降解和修飾、鈣信號(hào)調(diào)節(jié)。多數(shù)蛋白是參與氧化應(yīng)

7、激或氧化應(yīng)激相關(guān)疾病發(fā)病機(jī)理的重要蛋白，例如：14-3-3蛋白，CK BB，泛素羧基端水解酶-L1(UCHL-1)，ATP合成酶，突觸體相關(guān)蛋白(SNAP)，微管蛋白，肌動(dòng)蛋白等；而蛋白：醛縮酶C，ATP合成酶，CK BB，丙酮酸脫氫酶激酶，UCHL-1，14-3-3蛋白，dynamin1，SNAP，微管蛋白，肌動(dòng)蛋白等則屬于多種藥物依賴相關(guān)的共同蛋白。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了一些尚未報(bào)導(dǎo)的新蛋白，例如：鈣信號(hào)調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白novel protein

8、 similar to vertebrate EF hand calcium binding protein2，結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白novel intermediate filament protein，similar to centrosomal protein110 kDa。曲馬多同已知的依賴性藥物一樣主要通過(guò)三種普遍認(rèn)可的途徑引發(fā)神經(jīng)毒性，即能量代謝、氧化應(yīng)激和蛋白降解、修飾。 Western blotting和酶活性分析表明，

9、曲馬多慢性誘導(dǎo)上調(diào)14-3-3 epsilon蛋白表達(dá)量，和抑制酶縮酶和肌酸激酶(能量系統(tǒng)中的兩種重要酶)活性，且此類影響一直維持到撤藥后兩周仍十分顯著。相關(guān)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選和鑒定的曲馬多誘導(dǎo)的差異蛋白的可信度。曲馬多慢性誘導(dǎo)引起多種與氧化應(yīng)激和能量代謝密切相關(guān)的重要蛋白質(zhì)的表達(dá)量下調(diào)，而這些蛋白的差異表達(dá)都直接或間接的涉及線粒體結(jié)構(gòu)和功能的改變。曲馬多慢性處理后的線粒體超微結(jié)構(gòu)觀察顯示，線粒體分布紊亂，數(shù)目顯著下降，

10、基質(zhì)變稀。電子密度下降，出現(xiàn)腫脹、空泡樣，線粒體嵴數(shù)目減少、斷裂甚至是缺失等一系列與結(jié)構(gòu)和功能障礙密切相關(guān)的形態(tài)學(xué)變化。 基于行為學(xué)、藥物代謝、免疫印跡、酶學(xué)測(cè)定和超微結(jié)構(gòu)觀察等多種手段輔助下的蛋白質(zhì)組學(xué)及其相關(guān)技術(shù)篩選和鑒定曲馬多誘導(dǎo)的斑馬魚腦組織氧化應(yīng)激關(guān)鍵蛋白的結(jié)果，從細(xì)胞和分子水平揭示了曲馬多長(zhǎng)期濫用導(dǎo)致腦組織氧化應(yīng)激、線粒體損傷和蛋白修飾或降解相關(guān)的神經(jīng)毒性，以及引起能量系統(tǒng)失衡、細(xì)胞骨架破壞等，且很可能存在依賴性潛力